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《重庆医科大学》 2013年
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神经生长因子在离体大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及其非神经机制的研究

敖丽  
【摘要】:目的通过检测神经生长因子(nerve growth factor,NGF)在大鼠离体心脏缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,I/R)不同损伤程度的表达变化,进一步研究不同浓度外源性神经生长因子β对心脏缺血再灌注损伤的影响,并给予PI3K-Akt通路的阻断剂,以期探讨神经生长因子与大鼠心脏缺血再灌注损伤程度的关系、作用及可能机制。 方法 第一部分健康SPF级雄性SD大鼠48只,8~10周龄,体重200~300g,制备离体Langendorff心脏灌注模型后,采用随机数字表法,将离体心脏随机分为6组(n=8):假手术组(S组)、缺血组(I组)、缺血再灌注组(I/R组)、神经生长因子0.025组(N0.025组)、神经生长因子0.1组(N0.1组)、神经生长因子0.4组(N0.4组)。各组均先用K-H液平衡灌注20min,S组用K-H液继续灌注180min;I组灌注K-H液30min,停灌30min;缺血再灌注组灌注K-H液30min,停灌30min,复灌120min;N0.1组用含有0.1ng/ml神经生长因子的K-H液继续灌注20min,再用K-H液冲洗10min,停灌30min,复灌120min;N0.025组和N0.4组灌注液中的神经生长因子浓度分别为0.025、0.4ng/ml,灌注方式同N0.1组。待心脏跳动稳定后,于左心耳处插入乳胶水囊至左心室,用SCW-PTO1型压力传感器与RM6240B型多通道信号采集处理系统在平衡灌注末(T1)、停灌前即刻(T3)及再灌后5min (T4)、30min (T5)、60min (T6)、120min (T7)时记录各组的心率(HR)、左室舒张末压(LVEDP)、左室发展压(LVDP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)。在T1、T4、T5、T6、T7各时间点收集冠脉流出液,测定肌酸激酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)的水平,并于再灌注末取心肌组织,TUNEL法检测细胞凋亡,计算凋亡指数。用Western-blot法检测S组、I组、I/R组左心室前壁的神经生长因子的表达;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测其NGF mRNA的表达。 第二部分健康SPF级雄性SD大鼠32只,鼠龄8~10周,体重200~300g,制备离体Langendorff心脏灌注模型后,采用随机数字表法,将离体心脏随机分为4组(n=8):对照组(缺血再灌注组,即I/R组)、NGF预处理组(N组)、LY294002组(L组)、NGF+LY294002组(N+L组)。各组先用K-H液平衡灌注20min。随后对照组K-H液继续灌注60min,停灌30min,复灌120min;N组用含有0.1ng/mlNGF的K-H液继续灌注20min,K-H液灌注40min,再停灌30min,再灌注120min;L组用含有LY294002(1.5mg/kg)的K-H液持续灌注20min,再用K-H液灌注40min,停灌30min,复灌120min;N+L组先用含有LY294002(1.5mg/kg)的K-H液持续灌注20min,K-H液冲洗10min后再用含有0.1ng/ml神经生长因子的K-H液继续灌注20min,K-H液冲洗10min,停灌30min,再灌注120min。分别在平衡灌注末(T1)、灌注30min和60min(T2、T3)以及再灌注5(T4)、30(T5)、60(T6)和120min(T7)时记录各组的心功能指标(同第一部分)。在T1、T2、T4、T5、T6、T7各时间点收集冠脉流出液,测定肌酸激酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)的水平。用酶联免疫法检测再灌注末左心室前壁处心肌组织的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD);一部分左心室前壁处心肌组织用TUNEL法检测细胞凋亡,计算凋亡指数;另一部分左心室前壁处心肌组织采用Western-blot法检测不同组别Akt、pAkt、GRP78的表达;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组Akt mRNA、GRP78mRNA表达。 结果 第一部分与平衡灌注末相比,I/R组再灌注5min、再灌注30min的LVDP、HR、+dp/dtmax降低,LVEDP升高(P0.05),而S组四者在以上三个时间点无统计学差异;与S组相比,I/R组再灌注5min、再灌注30min的LVDP、+dp/dtmax和HR降低,LVEDP升高(P0.05)。与S组相比,I组和I/R组的LDH、CK升高(P0.05),以及NGF蛋白含量和NGF mRNA降低(P<0.05);与I组相比,I/R组心肌组织NGF蛋白和NGF mRNA减少(P0.05)。与T1时间点比较,I/R组、N0.025、N0.1组、N0.4组的T4、T5、T6、T7时LVDP、+dp/dtmax降低,LVEDP升高,而I/R组、N0.025组和N0.4组HR降低,N0.1组HR升高(P0.05);与I/R组相比,N0.1组T3、T4、T5、T6、T7时LVDP、+dp/dtmax和HR上升,LVEDP降低(P0.05),N0.025组LVEDP在T1、T3、T4、T5、T6、T7差异均无统计学意义,HR在T3、T4下降,T1、T5、T6差异无统计学意义,LVDP和+dp/dtmax在T3、T4、T5、T6、T7下降,T1差异无统计学意义(P0.05),N0.4组T3、T4、T5、T6、T7时LVDP、+dp/dtmax降低,LVEDP上升(P0.05),T1时各指标变化差异无统计学意义。与N0.1组相比,N0.025组和N0.4组T3、T4、T5、T6、T7时LVDP、+dp/dtmax和HR降低,LVEDP升高(P0.05)。与I/R组比较,N0.1组冠脉流出液CK、LDH在T4、T5、T6、T7四个时间点均降低,N0.025组T5、T6、T7三个时间点均升高,N0.4组T4、T5、T6、T7四个时间点均升高(P0.05)。各组T5时冠脉流出液CK、LDH浓度最高,随后逐渐降低。与对照组比较N0.1组细胞凋亡指数降低(P0.05),N0.025组差异无统计学意义,N0.4组升高(P<0.05)。 第二部分除了N组,其余各组,与T1时比较,T4、T5、T6、T7各组LVDP、 HR和+dp/dtmax均降低,LVEDP升高(P0.05),N组LVDP、 HR和+dp/dtmax均升高,LVEDP降低(P0.05)。与I/R组相比,N0.1组T2、T3、T4、T5、T6、T7时LVDP、+dp/dtmax和HR上升,LVEDP降低(P0.05);N+L组T3时刻LVDP、+dp/dtmax和HR上升,LVEDP降低(P0.05),其余各时点差异无统计学意义(P0.05);而L组各指标差异无统计学意义。与N组相比,各组HR、LVDP、+dp/dtmax在T2、T3、T4、T5、T6、T7时刻均降低,LVEDP上升(P0.05)。与T1相比较,四组各组的冠脉流出液CK、LDH浓度在T4、T5、T6、T7均上升,且T5时均达到最高,随着再灌注时间的延长,浓度逐渐降低。与I/R组比较,N组冠脉流出液CK、LDH浓度在T2、T3、T4、T5、T6、T7时间点均降低;N+L组冠脉流出液CK、LDH浓度在T3时间点降低,其余时间点差异无统计学意义;L组无统计学意义(P<0.05)。与I/R组比较,N组心肌组织SOD浓度升高,MDA浓度下降(P<0.05);L组和N+L组差异无统计学意义(P<0.05)。与I/R组比较,N组凋亡指数均降低;L组和N+L组无统计学意义(P<0.05)。相对于I/R组,N组Akt、pAkt、GRP78蛋白表达量和Akt mRNA升高(P<0.05),GRP78mRNA变化无统计学意义;L组四者蛋白表达和基因变化均无统计学意义;N+L组的Akt、pAkt、GRP78蛋白表达量和Akt mRNA下降(P<0.05)。 结论⑴大鼠离体心肌缺血再灌注损伤模型中NGF的表达量与损伤程度有关,其表达越低,损伤越严重。⑵0.1ng/ml的外源性神经生长因子预处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,0.4ng/ml时反而会加重心肌损伤。⑶外源性神经生长因子预处理能激活内质网应激反应,降低心肌细胞凋亡水平,PI3K/Akt信号通路通过调控内质网应激参与了其保护作用。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R541

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