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《重庆医科大学》 2013年
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血清SP-D定量检测方法的建立及其作为肺相关疾病标志物的探讨

刘萍  
【摘要】:目的: 1.采用多肽合成的方式制备SP-D抗原,以及制备SP-D多克隆抗体; 2.建立豚鼠HGPRT基因缺陷型瘤细胞系,并制备豚鼠SP-D单克隆抗体; 3.制备诊断用的纳米磁微粒; 4.建立SP-D纳米磁微粒化学发光免疫分析法(NM-CLIA)为基础的SP-D定量免疫学检测技术平台; 5. NM-CLIA定量检测人血清SP-D,并初步探讨血清SP-D在肺相关疾病中的临床意义。 方法: 1.应用DNAStar生物分析软件,采用Jameson-Wolf法和Emini法对SP-D蛋白的抗原指数和蛋白表面可及性进行预测,多肽合成SP-D抗原,经HPLC纯化,质谱鉴定,并采用重氮法制备SP-D-BSA,以此免疫原制备SP-D多克隆抗体; 2.豚鼠转化胚胎细胞104C1细胞经200rad60Coγ射线辐照诱导,并用8-AG培养筛选出HGPRT基因缺陷型瘤细胞,以此豚鼠瘤细胞制备豚鼠SP-D单克隆抗体;*本课题由国家自然科学基金资助(30872417) 3.采用共沉淀法制备葡聚糖包覆的纳米磁性微粒,经表面羧基化处理后得到诊断用的纳米磁微粒,并以EDC法制备成纳米磁微粒-SA; 4.建立血清SP-D纳米磁微粒化学发光免疫分析法,并对其进行方法学评价; 5.以建立的NM-CLIA试剂定量测定健康人、矽尘暴露人群、ILD患者、ALI患者和COPD患者血清中SP-D蛋白水平,并初步评价其作为肺相关疾病诊断生物标志物的临床意义。 结果: 1.应用DNAStar生物分析软件预测到三个SP-D线性抗原表位暴露机率相对较大氨基酸序列分别为:1(20-35aa),2(42.71aa),8(316-332aa),本次实验选择线性抗原表位暴露机率最大一段多肽:1(20-35aa),氨基酸序列为:eaemktyshrtmpsac(16aa;MW:1875Da)HPLC纯化后多肽纯度为95.5%,经质谱鉴定偶联比为:SP-D:BSA=4.9:1;多抗纯度95%,效价1:106; 2.建立了能稳定分泌豚鼠SP-D单克隆抗体的5株杂交瘤细胞株,分别命名为2B2、3F1、3H4、4C7和5A3,经类似物的交叉反应实验证实,其中2B2、3F1、4C7和5A3的特异性良好,与SP-D可进行特异性结合,对SP-A、SP-B、SP-C不发生交叉反应。经连续冻存40次后,3F1分泌抗体的能力最稳定;经Protein G亲和纯化系统大量制备SP-D单克隆抗体,纯度97%,效价1:106,并能识别特异性的SP-D蛋白的(20-35aa)肽段。 3.制备所得纳米磁性微粒粒径约300nm,均一性良好。并以EDC法制备成纳米磁微粒-SA,37℃烘箱破坏试验7天后,稳定性良好; 4.建立了SP-D NM-CLIA定量检测方法;该法最低检测限为0.22ng/ml,线性范围1.0-1000.0ng/ml,Hook效应在50000ng/ml才出现;批内与批间变异系数均6.0%;稀释回收率为91.17%~106.42%,添加回收率为91.00%~109.63%;与SP-A(10000ng/ml)、SP-B(10000ng/ml)和SP-C(10000ng/ml)交叉反应率低于0.1%;0.2mg/ml胆红素、5mg/ml血红蛋白、10mg/ml甘油三酯、1500U/ml的类风湿因子(RF)、抗凝剂,研究样本冻融3次和冻存120天对测值的无明显影响;整个检测所需时间约22min; 5.与正常对照组(29.33±7.41ng/ml)比较,矽尘暴露组(48.67±17.79ng/ml)、0+组(95.23±24.83ng/ml)、I期矽肺组(160.28±39.05ng/ml)、间质性肺病(ILD)组(85.57±25.12ng/ml)、急性肺损伤(ALI)组(93.64±44.94ng/ml)、慢性阻塞性肺病(COPD)组血清SP-D含量均增高,差异均有统计学意义(P0.01);与矽尘暴露组比较, ILD组、ALI组、COPD组、0+组和I期矽肺组血清SP-D含量均增高,差异均有统计学意义(P0.01);矽肺I期组血清SP-D含量仍然高于0+组、ILD组、ALI组、COPD组,差异均有统计学意义(P0.01);血清SP-D含量与矽肺病情分级呈正相关性(rs=0.764,P0.01)。COPD组血清SP-D含量高于ILD组、ALI组,差异均有统计学意义(P0.01);0+组、ILD组和ALI组三组间差异无统计学意义。 结论: 1.成功制备了SP-D多肽蛋白及其多抗; 2.成功建立了豚鼠HGPRT基因缺陷型豚鼠瘤细胞系,并制备了豚鼠SP-D单克隆抗体; 3.成功制备出了诊断用的纳米磁微粒; 4.成功建立了性能稳定的血清SP-D定量检测NM-CLIA法; 5.血清SP-D水平可作为肺相关疾病辅助诊断的生物标志物。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R446.6

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【参考文献】
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