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《重庆医科大学》 2015年
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结核分枝杆菌新的分子标志物筛选及clpP2基因在结核病快速诊断中的初步应用

李岱容  
【摘要】:背景:结核病仍是一个致死性传染病,全球有三分之一的人口潜在性感染结核,更有三分之一的结核病人未得到诊断和治疗。目前对肺结核病人的诊断仍然依赖于细菌学方法,比如痰涂片、结核分枝杆菌培养,而这些方法远远不能满足临床病人的需要。为控制结核病,WHO全球行动计划的主要焦点是发展简单和节省费用的诊断方法,以提高病例的检测。但是目前结核病诊断仍缺乏精确迅速的POINT-OF-CARE (POC)诊断测试。因此迫切需要寻找特异性好、敏感性高的分子靶标以及发展相应的费用低廉的快速床旁诊断测试,这有利于结核病能够得到早期的诊断、治疗和疫情控制。本研究采用生物信息学与实验方法相结合,鉴定和评价适合用于结核病诊断的分子靶标,建立高灵敏度和特异性且对仪器依赖程度低的结核分枝杆菌快速检测方法。方法:1.通过对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)全基因组序列分析,检测Mtb必需基因序列单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)和插入/缺失(insertion/deletions, Indels)。筛选SNPs、indels发生率尽可能低的必需基因,作为结核病的潜在分子诊断靶标。本研究从这些候选基因中选择clpP2基因进行验证。2.采用生物信息学方法详细评价Mtb clpP2基因的诊断潜能。计算分枝杆菌属clpP2基因核苷酸组成、密码子偏性、变异性,对clpP2基因DNA多态性进行了分析,推测clpP2基因发生HGT事件可能性。构建clpP2基因分子进化树,评价clpP2基因对Mtb与非结核分枝杆菌的区分能力。通过同源对比分析,从信息学角度评价clpP2基因靶标的种属特异性。3.环介导等温扩增方法(Loop Mediated Isothermal Amplification, LAMP),是一种新的核酸扩增方法,己广泛用于床旁(Point-of-care)测试。本研究以结核分枝杆菌clpP2基因为靶标,建立可视LAMP检查方法,在本研究中将其命名为可视clpP2-LAMP。本实验对clpP2-LAMP反应条件进行优化,评价clpP2-LAMP敏感性和特异性及在临床标本检测中的应用价值。4.从信息学角度推测Mtb ClpP2蛋白用于结核病的诊断应该具有一定的特异性,因此本研究原核表达Mtb ClpP2蛋白,制备anti-ClpP2兔多克隆抗体,对ClpP2蛋白在细胞内的亚定位、不同应激条件下细菌体内的表达水平、免疫特性进行了分析,进一步测定结核病人血清中ClpP2蛋白及抗体水平,分析其在临床中的应用价值。结果:1.从H37Rv基因组中共下载61 5个必需基因,利用GMTV (Genome-wide Mycobacterium tuberculosis variation)数据库对这些必需基因序列进行SNPs、 indels进行分析,将SNPs和indels发生率均1%的必需基因作为潜在的诊断靶标,共筛选到45个必需基因。clpP2基因具有很低的单核苷酸多态性和种属特异性,是本研究进一步研究的靶标分子。2.对分枝杆菌属clpP2基因进行了较为详尽的序列分析:(1)对其核苷酸组成、密码子偏性、变异性及DNA多态性进行了分析,表明clpP2基因高度保守,不易发生HGT事件;(2)分析Mtb的clpP2基因同源序列,在呼吸道非Mtb病原体基因组中没有发现同源核酸序列,而编码氨基酸序列进行对比,同源程度大约为50%左右,该结果表明clpP2基因用作分子诊断靶标具有很好的特异性;(3)构建了clpP2基因进化树,clpP2进化树的拓扑结构与16s rRNA的拓扑结构相似,但是进化距离明显比16s rRNA的进化距离大,能够将Mtb与非结核分枝杆菌属区分。3.基于Mtb clpP2基因,成功建立了可视的clpP2-LAMP法。clpP2-LAMP法的敏感性高于普通PCR 100倍,用87株分枝杆菌和18株非分枝杆菌验证clpP2-LAMP法的准确性,准确性为100%。将clpP2-LAMP法直接用于临床标本的检测,共检测152例,与“金标准”培养法结果相比符合度为98%。4.成功克隆和重组Mtb ClpP2蛋白酶在大肠杆菌中表达。结果表明,Mtb ClpP2蛋白酶有较强的免疫原性,可刺激机体产生多克隆抗体。肺结核患者血清ClpP2抗原和抗体水平均增加。CIpP2抗原对结核病诊断ROC曲线下的面积(AUC)为0.911,敏感性为72.2%,特异性为91.3%。结论:经过生物信息学分析,Mtb clpP2基因高度保守,具有种属特异性,是潜在的结核病诊断的新靶标,是已知分子标志物的补充。以Mtb clpP2基因为靶标建立的LAMP结核检测方法,以及以Mtb ClpP2蛋白酶为基础的血清诊断方法在临床标本应用中具有较高的价值。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R52

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