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《重庆医科大学》 2016年
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曲美他嗪通过mTORC_2/SGK_1通路对脂多糖所致急性肺损伤的治疗作用及其机制的研究

刘振峰  
【摘要】:研究背景急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome)是以肺内弥漫性炎细胞浸润、肺组织循环障碍、肺毛细血管通透性增加及低氧血症为特点的临床综合征,目前是呼吸与危重症医学研究的重点、难点,预后极差,病情凶险,可迅速进展为多器官功能不全,为此防治本类疾病对临床有重要意义。目前国内外已经进行了一系列的基础与临床实验研究,但未阐明ALI/ARDS的发病机制。如果能有效地清除肺泡腔内过多的水肿液,对维持患者气体交换和改善氧合指数非常重要,同时可降低此类患者的病死率和死亡率。肺泡上皮钠通道(epithelial sodium channel,ENa C)是肺泡腔内钠水转运和推动水肿液清除的重要环节,是完成肺泡腔内钠离子跨膜转运的限速步骤和提供肺泡清除(alveolar fluid clearance,AFC)的源动力,亦协同钠/钾ATP酶共同完成钠水转运过程,在肺泡清除中发挥重要的作用。初始有关ALI/ARDS的研究主要集中在炎症假说方面,比如糖皮质激素、自由基清除剂、抗氧化剂及肺泡表面活性物质等,并涉及如下机制调控(如图-2所示),通过支持、抗炎及辅助通气等综合治疗后仍存在疗效不满意或产生不良反应。因此,解决某一方面的问题很难对疾病的治疗起到根本性作用。治疗ALI/ARDS的关键步骤是把过多的水肿液排除到肺泡腔外,来推动肺水清除,这对维持气体交换和恢复氧合指标具有重要的指导意义。肺泡上皮细胞本身具有清除过多液体的能力,脂多糖内毒素诱发的损伤是引起ALI/ARDS水肿液聚集的重要因素。本研究拟通过SGK_1途径在保护肺泡上皮细胞的同时可增强肺泡水肿液清除(AFC),对临床治疗ALI/ARDS具有重要的意义,为探索ENa C在AFC的作用机制更具有一定的临床实用价值,亦为寻找一种有效调控ENa C及上游信号通路的药物提供新的治疗靶点。mTOR是丝氨酸-苏氨酸的高度保守序列,在细胞生长、代谢及存活过程中发挥核心控制作用[12]。根据mTOR结构、功能以及对雷帕霉素敏感性的不同可分为mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC_2)两条不同的信号通路。其中mTORC_2属于PIKK家族成员,在调节钠离子转运、蛋白翻译等过程中起重要的调节作用[13]。同时亦是来自上游的细胞内外信号向下游转导的感应器[20],对ENa C具有正调节功能。曲美他嗪是一种心肌保护药,在心脏中的研究甚多[8],是通过其抑制脂肪酸β氧化[9],促进葡萄糖有氧氧化[10],来降低产生ATP所需的氧耗及产生高能键,亦具有清除自由基、稳定细胞膜的作用。研究发现此药在急性胰腺炎中能炎性介质IL-1a、IL-6及TNF-a水平明显降低,有利于保护胰腺组织[21]。其作用机制是通过活化细胞膜表面的ATP酶,抑制氧化应激(ROS)及影响mTORC通路来发挥药理学作用。此药在急性肺损伤中的相关研究尚未见报道,本课题拟用曲美他嗪干预mTORC_2/SGK_1信号通路来观察对LPS所致急性肺损伤的疗效,为临床治疗ALI/ARDS提供一种新的治疗途径。目的从体内和体外实验两个层面研究曲美他嗪干预ALI/ARDS模型,观察其能否调控mTORC_2/SGK_1信号通路及对ENa C作用的分子机理,为ALI/ARDS发病机制的研究提供基础和对治疗提供新思路。方法本实验由三部分组成1.第一部分:从体外实验探讨mTORC_2/SGK_1信号通路对ENa C的影响通过体外细胞培养实验来检测mTORC_2/SGK_1信号通路对ENa C活性的影响;采用ELISA检测炎性因子和WB、免疫荧光等方法说明该通路对ENa C各亚基的表达。2.第二部分:通过体内实验检测mTORC_2/SGK_1信号通路对ENa C活性的影响,来观察该通路对ENa C各亚基的表达。通过体内实验检测mTORC_2/SGK_1信号通路对ENa C活性的影响;采用ELISA、WB、免疫组化及干/湿重等手段检测该通路对ENa C的表达。3.第三部分:曲美他嗪对LPS所致肺损伤中mTORC_2/SGK_1信号通路保护机制的相关研究通过曲美他嗪干预LPS所致急性肺损伤中mTORC_2/SGK_1信号通路及观察对ENa C各亚基的表达,为临床治疗该病提供一种新的思路和方法。结果1.从体外实验探讨mTORC_2/SGK_1信号通路对ENa C各亚基的表达我们利用促炎介质IL-6,IL-8和TNF-α作为急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征恶化的炎性调节器。收集细胞上清液通过ELISA法测定IL-6、IL-8及TNF-α。我们发现在体外建立的ALI模型中IL-6、IL-8和TNF-α分泌均是增加的。2.从体内实验探讨mTORC_2/SGK_1信号通路对ENa C的影响由于ENa C在mTORC_2/SGK_1信号通路的下游,据报道mTOR在ALI/ARDS中起重要的作用[1-3]。这个证据促使我们假设mTORC_2/SGK_1信号通路能调节ENa C。我们采用W-B测定mTOR和SGK_1蛋白水平来验证这个假设是成立的。结果表明:mTORC_2/SGK_1信号通路能调节ENa C的各亚基。3.曲美他嗪对LPS所致肺损伤中mTORC_2/SGK_1信号通路保护机制的相关研究在脂多糖诱导组等离子体膜中ENAC各亚基的表达降低,经曲美他嗪治疗后各亚基恢复正常;炎性因子的分泌明显减少,表明曲美他嗪不仅能减轻炎症反应,而且通过增加ENAC各亚基的表达来提高Na+转运,进而减轻肺水肿;在脂多糖诱导细胞组曲美他嗪能上调mTOR,并通过其增加SGK_1的表达,表明此药能调节mTORC_2/SGK_1通路;脂多糖治疗的小鼠干/湿重比是显著增加的,然而,通过曲美他嗪治疗后其比值降低(与药物浓度呈正比)。结论:1.从体内外急性肺损伤模型中曲美他嗪能减轻肺损伤和肺水肿,故为此病的治疗提供一个新的治疗途径。2.在脂多糖诱导的细胞、动物模型中,曲美他嗪能通过减少促炎细胞因子的分泌来减轻急性肺损伤的炎症反应。3.曲美他嗪通过增加ENa C的表达来促进肺泡腔水肿液清除,其机制不依赖于减轻炎症,而是依赖于肺泡上皮钠通道的离子转运。4.在脂多糖诱导的模型中,曲美他嗪能降低mTOR蛋白表达的水平及增加SGK_1蛋白水平的表达。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R563.8

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