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《重庆医科大学》 2017年
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DDX17调控HBV复制的分子机制

罗英英  
【摘要】:目的HBV感染过程是病毒与宿主因子发生相互作用、相互影响的过程。在抵御病毒感染方面,一些细胞内宿主因子具有抗病毒效应,从而对宿主免疫系统有补充作用。DEx D/H-box家族蛋白是RNA解旋酶家族中重要亚家族。有研究报道该家族中一些成员可参与抵抗病毒感染。然而关于DEx D/H-box家族蛋白在HBV复制调控中作用的报道非常有限。本研究筛选了可抑制HBV复制的DEx D/H-box家族成员,并对其中的DDX17在HBV复制调控中的作用及分子机制进行了研究。方法1.通过NCBI/BLAST数据库查询目前已经发现的所有DEx D/H-box解旋酶家族蛋白种类;2.以Hep G2细胞来源c DNA为模板,利用RT-PCR方法,分别扩增DEx D/H-box家族基因家族基因,并将目的基因片段连接至载体p CH9;3.构建HBV核心启动子荧光素酶报告基因p CH9-pcore-Rluc;4.在Hep G2细胞中,分别共转染各种目的基因表达质粒与p CH9-pcore-Rluc或空载体与p CH9-pcore-Rluc,转染48 h后收集细胞进行荧光素酶报告检测;5.使用Western blot检测方法鉴定DDX17在Hep G2细胞中过表达水平;6.使用Southern blot检测方法鉴定过表达DDX17对Hep G2细胞中HBV复制中间体表达水平的影响;7.使用Western blot检测方法鉴定DDX17在Huh7细胞中过表达水平;8.使用Southern blot检测方法鉴定过表达DDX17对Huh7细胞中HBV复制中间体表达水平的影响;9.使用Northern blot检测方法鉴定过表达DDX17对Hep G2细胞中HBV转录水平的影响;10.使用Northern blot检测方法鉴定过表达DDX17对Huh7细胞中HBV转录水平的影响;11.通过ELISA方法检测过表达DDX17对肝癌细胞Hep G2上清中HBe Ag分泌量的影响;12.通过ELISA方法检测过表达DDX17对肝癌细胞Huh7上清中HBe Ag分泌量的影响;13.通过ELISA方法检测过表达DDX17对肝癌细胞Hep G2上清中HBs Ag分泌量的影响;14.通过ELISA方法检测过表达DDX17对肝癌细胞Huh7上清中HBs Ag分泌量的影响;15.通过RT-PCR方法检测DDX17对ER-α、ZAP或IFN信号途径中节点分子表达水平的影响;16.构建DDX17基序Ic和基序Ⅱ突变体A1004T+C1007G、A1077C+A1086C;17.将质粒DDX17TPGRM、DDX17DEADM、wt DDX17或DDX17空载与HBV1.3共转染Hep G2细胞,裂解细胞并进行Southern blot检测和Northern blot检测;18.体外转录HBV?茎环结构,并与过表达DDX17的细胞蛋白裂解液进行共孵育,进行RNA-Protein Pull-Down实验;19.利用CRISPR/Cas9系统构建DDX17基因敲除Hep G2细胞系,使用测序及Western blot方法鉴定DDX17表达是否缺失;20.在DDX17KO细胞中过表达外源DDX17表达质粒,利用Western blot检测DDX17蛋白表达水平;21.在DDX17KO细胞中共表达DDX17空载体质粒与HBV1.3,做Real-time PCR检测分析和Southern blot检测;22.在DDX17KO和Hep G2细胞中分别共转染p CH9-pcore-Rluc和CMV-Fluc,做双荧光素酶报告系统分析;23.在Hep G2-DDX17KO细胞中,分别共转染DDX17、p CH9-pcore-Rluc与CMV-Fluc或者vector、p CH9-pcore-Rluc与CMV-Fluc做双荧光素酶报告检测分析;24.构建HBV核心启动子截短突变体;25.在Hep G2细胞中分别共转上述突变体与CMV-Fluc,做双荧光素酶报告系统分析;26.在DDX17KO和Hep G2细胞中分别共表达p CH9-BCP-Rluc和CMV-Fluc做双荧光素酶报告系统分析;27.在DDX17KO和Hep G2细胞中分别共表达p CH9-1636-Rluc和CMV-Fluc、p CH9-1635/1744-Rluc和Fluc做双荧光素酶报告系统分析。结果1.目前已经发现的人源性DEx D/H-box RNA解旋酶有58个,包括16个DHX(DEAH/DEx H家族)和42个DDX(DEAD/DEx D家族);2.成功构建27种DEx D/H-box RNA解旋酶基因真核细胞表达质粒;3.成功构建HBV核心启动子荧光素酶报告质粒p CH9-pcore-Rluc;4.与对照组相比,DDX17可以显著负向调控HBV启动子活性(P0.0001);5.与对照组相比,在Hep G2细胞中转染DDX17表达质粒后DDX17蛋白表达水平明显升高;6.与对照组相比,在Hep G2细胞中过表达DDX17后HBV复制中间体表达水平明显下降;7.与对照组相比,在Huh7细胞中转染DDX17表达质粒后DDX17蛋白表达水平明显升高;8.与对照组相比,在Huh7细胞中过表达DDX17后HBV复制中间体表达水平明显下降;9.与对照组相比,在Hep G2细胞中过表达DDX17后HBV 3.5/3.4kb RNA和2.4/2.1kb RNA表达水平均明显下降;10.与对照组相比,在Huh7细胞中过表达DDX17后HBV 3.5/3.4kb RNA和2.4/2.1kb RNA表达水平均明显下降;11.在Hep G2细胞中,与对照组相比,过表达DDX17后HBe Ag分泌量显著低于对照组(P=0.0032);12.在Huh7细胞中,与对照组相比,过表达DDX17后HBe Ag分泌量显著低于对照组(P0.0001);13.在Hep G2细胞中,与对照组相比,过表达DDX17后HBs Ag分泌量显著低于对照组(P=0.0004);14.在Huh7细胞中,与对照组相比,过表达DDX17后HBs Ag分泌量显著低于对照组(P=0.0035);15.未发现过表达DDX17后与对照组中ER-α、ZAP或IFN信号途径中节点分子m RNA表达水平有显著差异;16.成功构建DDX17基序Ic和基序Ⅱ突变体TPGRM和DEADM;17.突变TPGR结构域后,HBV DNA及HBV RNA水平明显高于DDX17野生型对照组、而接近空载体对照组;而突变DEAD结构域则未发现HBV DNA及HBV RNA与DDX17野生型对照组有明显差异;18.HBV?茎环并不能直接与DDX17发生结合;19.成功构建4个Hep G2-DDX17KO细胞系;20.DDX17KO细胞本身并不表达DDX17蛋白,外源DDX17表达质粒c-Myc-DDX17可以在DDX17KO细胞中正常表达;21.Real-time PCR结果发现DDX17KO细胞中共转染空载体质粒与HBV1.3后检测到的HBV复制中间体表达水皮显著高于对照细胞系Hep G2(P=0.0101),Southern blot结果同样发现DDX17KO细胞中共转染空载体质粒与HBV1.3检测到的HBV复制中间体表达水平明显高于对照细胞系Hep G2;22.与对照细胞系Hep G2相比,DDX17KO细胞中Rluc活性显著升高(P0.0001);23.与对照组相比,DDX17KO细胞中补充外源DDX17后Rluc活性显著下降(P=0.0004);24.成功构建HBV核心启动子截短突变体;25.DDX17可抑制p CH9-pcore-Rluc启动子活性,而对截短体,无论是同时缺失Enh Ⅰ和Enh Ⅱ,或者缺失Enh Ⅰ,均表现为正向调控作用;Enh Ⅰ的贡献率超过85%,而Enh Ⅱ仅达8.5%;并且与对照组相比,过表达DDX17后Enh Ⅰ贡献率下降11%,过表达DDX17后Enh Ⅱ及BCP贡献率均有小幅度升高;26.与对照细胞系相比,DDX17KO细胞BCP启动子活性并无显著差异;27.与对照细胞系相比,DDX17KO细胞中p CH9-1636-Rluc启动子活性显著降低(P=0.0256),p CH9-1635/1744-Rluc启动子活性显著升高(P=0.0018)。结论本研究从人源性RNA解旋酶家族入手,筛选出该家族中的DDX17在HBV复制中发挥重要调控作用。本研究结果显示DDX17能使HBV复制和转录水平下调,DDX17可通过其RNA结合基序抑制HBV核心启动子及Enh Ⅰ活性,从而抑制HBV复制和转录。
【关键词】:DDX17 乙型肝炎病毒 核心启动子
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R373.21
【目录】:
  • 英汉缩略语名词对照7-10
  • 中文摘要10-17
  • 英文摘要17-24
  • 第一部分 筛选对HBV复制有潜在影响的DExD/H-box家族蛋白24-60
  • 1 材料与方法24-47
  • 1.1 材料24-28
  • 1.1.1 细胞系24-25
  • 1.1.2 质粒和菌株25
  • 1.1.3 主要试剂(盒)25-26
  • 1.1.4 仪器设备26-27
  • 1.1.5 试剂配制27-28
  • 1.2 方法28-47
  • 1.2.1 查询DExD/H-box解旋酶家族蛋白成员28
  • 1.2.2 细胞复苏28
  • 1.2.3 细胞传代28
  • 1.2.4 细胞冻存28-29
  • 1.2.5 细胞铺板29
  • 1.2.6 提取HepG2细胞总RNA(12 孔板培养皿)29
  • 1.2.7 检测RNA浓度29-30
  • 1.2.8 逆转录成cDNA30
  • 1.2.9 扩增目的基因片段30-39
  • 1.2.10 胶回收39
  • 1.2.11 检测DNA浓度39
  • 1.2.12 将目的基因片段连接至载体39-41
  • 1.2.13 制备电转感受态细菌JM10941
  • 1.2.14 电击转化JM10941-42
  • 1.2.15 转化产物测序分析42
  • 1.2.16 小量抽提质粒42-43
  • 1.2.17 酚氯仿初筛43
  • 1.2.18 大量抽提质粒43-44
  • 1.2.19 HBV核心启动子荧光素酶报告质粒构建44-45
  • 1.2.20 细胞转染45-46
  • 1.2.21 海肾荧光素酶检测系统分析46-47
  • 2 结果47-52
  • 2.1 人源性RNA解旋酶家族成员查询结果47-50
  • 2.2 目的基因哺乳动物细胞表达质粒构建成功50-51
  • 2.3 成功构建HBV核心启动子荧光素酶报告质粒51
  • 2.4 RNA解旋酶蛋白对HBV启动子活性影响51-52
  • 3 讨论52-55
  • 参考文献55-60
  • 第二部分 DDX17对HBV转录和复制的影响60-82
  • 1 材料与方法61-69
  • 1.1 材料61-64
  • 1.1.1 细胞系61
  • 1.1.2 主要试剂(盒)61-62
  • 1.1.3 仪器设备62
  • 1.1.4 试剂配制62-64
  • 1.2 方法64-69
  • 1.2.1 提取细胞总蛋白样品(6 孔板)64
  • 1.2.2 蛋白浓度测定64-65
  • 1.2.3 Western blot检测65
  • 1.2.4 提取复制中间体65-66
  • 1.2.5 Southern blot检测66-67
  • 1.2.6 HBsAg ELISA试剂盒检测67-68
  • 1.2.7 HBeAg ELISA试剂盒检测68
  • 1.2.8 Northern blot检测68-69
  • 1.2.9 统计方法69
  • 2 结果69-75
  • 2.1 过表达DDX17对HepG2细胞中HBV复制中间体表达水平的影响69-70
  • 2.2 过表达DDX17对Huh7细胞中HBV复制中间体表达水平的影响70-71
  • 2.3 过表达DDX17对HepG2细胞中HBV转录水平的影响71-72
  • 2.4 过表达DDX17对Huh7细胞中HBV转录水平的影响72-73
  • 2.5 过表达DDX17对肝癌细胞中HBV蛋白表达水平的影响73-75
  • 3 讨论75-78
  • 参考文献78-82
  • 第三部分 DDX17调控HBV复制分子机制82-120
  • 1 材料与方法83-96
  • 1.1 材料83
  • 1.1.1 细胞系83
  • 1.1.2 主要试剂(盒)83
  • 1.2 方法83-96
  • 1.2.1 RT-PCR检测节点分子mRNA转录水平83-85
  • 1.2.2 构建DDX17结构域突变体85-87
  • 1.2.3 RNA-Protein Pull-Down87-89
  • 1.2.4 构建HBV核心启动子截短突变体89-90
  • 1.2.5 构建Fluc报告基因表达质粒90-91
  • 1.2.6 利用CRISPR/Cas9系统构建DDX17敲除HepG2细胞系91-93
  • 1.2.7 HBV复制中间体Real-time PCR93-94
  • 1.2.8 双荧光素酶报告基因检测94-96
  • 2 结果96-111
  • 2.1 DDX17介导的HBV RNA抑制并非通过ER, ZAP和IFN-α 信号途径发挥效应96-97
  • 2.2 成功构建DDX17突变体97-101
  • 2.3 DDX17下调HBV转录并不依赖DDX17 ATP酶活性101-102
  • 2.4 DDX17对HBV复制的抑制并非通过直接与HBV RNA stem loop的 ? 茎环部位结合102-103
  • 2.5 成功利用CRISPR/Cas9系统构建DDX17基因敲除HepG2细胞系103-104
  • 2.6 HBV在DDX17KO细胞中复制水平能回复104-107
  • 2.7 在DDX17KO细胞DDX17可抑制HBV核心启动子107-108
  • 2.8 DDX17对HBV复制及转录的负向调节作用主要是通过抑制Enh Ⅰ活性发挥效应108-111
  • 3 讨论111-114
  • 参考文献114-120
  • 全文总结120
  • 本课题创新点120-121
  • 文献综述121-134
  • 参考文献126-134
  • 致谢134-135
  • 博士期间发表论文135

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