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《重庆医科大学》 2017年
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脂肪酸转运酶CD36在HBV病毒复制中的作用及分子机制研究

黄健  
【摘要】:目的乙型肝炎病毒(HBV)是一种与宿主代谢密切相关的病毒,宿主营养及代谢状态影响HBV病毒复制、合成及感染能力,而HBV感染也可明显上调一些宿主代谢相关基因的表达,如脂肪酸合成酶(FAS),当敲低FAS的表达可以抑制HBV复制水平。脂肪酸转运酶(CD36)是参与脂质代谢过程的重要膜糖蛋白分子,在长链脂肪酸的跨膜转运及代谢性炎症的发生中起着重要作用。近年研究发现,CD36可与丙型肝炎病毒(HCV)E1蛋白相互作用促进HCV的入侵与复制;CD36还影响人类免疫缺陷病毒(HIV)的组装与分泌。有趣的是,我们在表达HBV的HepG2.2.15细胞中发现CD36表达水平显著增加,因此,推测CD36表达水平变化可能与HBV生命活动存在联系。本研究拟探讨脂肪酸转运酶CD36是否会影响HBV复制及其可能的分子机制。方法在两种HBV复制的HepG2.2.15、HepAD38细胞中,利用CD36过表达和靶向RNA干扰(RNAi)慢病毒构建CD36过表达和CD36基因沉默细胞模型。用C57BL/6J野生型(WT)小鼠和CD36基因敲除(CD36KO)小鼠为动物模型,经尾静脉水动力注射PGEM-HBV1.3质粒,建立hbv急性感染模型。通过体内外实验观察cd36过表达和cd36基因敲低对hbv复制水平的影响。用转录组测序法筛选hepg2.2.15-cd36过表达与对照细胞转录组中的差异表达基因,以探寻cd36影响hbv复制的可能分子机制。以流式细胞技术分析cd36表达水平的改变对细胞内钙离子水平的影响。使用钙离子螯合剂bapta-am处理cd36过表达细胞,以及用提升胞浆内钙离子的毒胡萝卜素处理cd36rnai细胞,提取hbvdna进行荧光定量pcr检测,分析钙离子试剂对cd36诱导的hbv复制的影响。用westernblotting方法检测cd36过表达对src酪氨酸激酶磷酸化水平的影响,以src激酶抑制剂su6656处理cd36过表达细胞观察hbv复制水平变化。结果southernblot及荧光定量pcr结果均显示,无论是hepg2.2.15还是hepad38细胞中,cd36过表达组与对照组相比,细胞中hbv的复制水平显著增加;而cd36基因沉默后,hbv复制水平明显下降。此外,cd36过表达组hbeag、hbsag的表达水平也高于对照组,cd36rna干扰组hbeag、hbsag的表达水平显著低于对照组。在急性hbv感染小鼠模型中,cd36ko抑制hbvdna水平以及hbeag、hbsag、hbcag的表达。转录组测序结果显示,cd36过表达影响细胞内一些离子通道蛋白和钙离子结合蛋白的表达。进一步的研究显示,cd36过表达可以增加细胞内ca2+水平,而cd36基因沉默后的细胞内ca2+水平呈下降趋势。钙离子螯合剂bapta-am降低细胞内钙离子能抵消cd36过表达所导致的hbv复制增加,同样毒胡萝卜素能依靠增加细胞内的钙离子水平而恢复CD36基因沉默后所导致的HBV减少的趋势。由于Src酪氨酸激酶与细胞内钙离子稳态和HBV复制相关,本研究发现CD36过表达能够增加Src酪氨酸激酶磷酸化水平,而Src酪氨酸激酶抑制剂SU6656能够抑制HBV复制。结论宿主脂质代谢的关键调节因子CD36可通过影响细胞内Ca2+水平和Src酪氨酸激酶途径而调节HBV的复制。该研究将有助于我们进一步了解宿主营养代谢与HBV间的关系,为未来通过调节宿主代谢而建立针对HBV的防治策略提供理论依据。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R373.21

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