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《重庆医科大学》 2017年
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人骨髓间充质干细胞衰老的动态生物学研究

陈雄斌  
【摘要】:目的:衰老是生物体不可避免的生命规律。随着生物体年龄的增加,机体器官的组织结构和生理功能进行性衰退,最终引起衰老相关老年性疾病。目前,对于衰老研究形成了多种衰老学说,其中干细胞衰老学说是解释机体衰老的最新学说,该学说认为:生物体的衰老实际上是它的干细胞衰老,所有衰老现象包括组织器官退变、功能丧失、肿瘤发生和反复感染等老年性疾病都可以反映出成体干细胞衰老的水平。此外,由于干细胞的衰老导致其自我更新和多向分化能力衰退,这也必将导致组织器官结构与功能的逐渐衰退、损伤组织难以修复再生和伴随疾病的产生。科学家提出:干细胞是研究细胞衰老的最好模型,寻找重新激活干细胞的方法和调控它靶向分化在预防老年疾病和治疗退行性疾病中有不可估量的价值。造血诱导微环境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)是造血干细胞(haemopoietic stem cells,HSCs)赖以生长发育和增殖分化的场所,其结构和功能完整是维系正常造血功能的重要因素。造血基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)作为HIM的核心组分,不仅通过形成HSCs生长发育的“龛”、分泌造血生长因子和细胞外基质等方式支持和调控HSCs自我更新与分化,还与多种血液系统疾病的发生、发展和预后密切相关,因此骨髓基质细胞成为研究HIM结构与功能最为重要的研究对象。课题组前期研究证明,随着小鼠年龄增加,其HSCs也随之衰老,最终导致衰老相关性老年疾病的发生。现代造血理论认为,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)对于维持造血诱导微环境的稳态具有重要意义,它可以增殖、分化形成多种BMSCs,此外,BMMSCs还可以通过分泌多种造血调控因子调控造血干细胞功能。因此,BMMSCs成为研究造血诱导微环境重要对象。最新研究表明,体外培养的BMMSCs会随着传代数的增加而出现衰老,最终导致相关功能的丧失。随着年龄增加,人BMMSCs衰老的动态生物学特征规律还不清楚。本文采用现代干细胞研究的最新手段,深入探讨随着年龄的增加人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMMSCs)衰老的动态生物学规律,旨在为探索延缓或预防造血微环境衰老途经提供理论及实验依据。方法:1.人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)的分离与鉴定:采集健康人骨髓,分离骨髓单个核细胞(BNCS),体外贴壁培养BNCS,传代至第三代(P3),收集P3代细胞,流式细胞术鉴定细胞表面CD90、CD73、CD11b、CD19、CD14和HLA-DR的表型表达。2.采集健康人骨髓,分离骨髓单个核细胞(BNCS),贴壁培养至P3,根据年龄分为:青年组(10例,15~25岁),中年组(12例,26~45岁),中老年组(15例,45~65岁),老年组(12例,65岁),分组后进行以下检测。(1)增殖分化能力检测:采用CCK-8检测各组hBMMSCs的增殖能力,使用成骨分化诱导剂和成脂分化诱导剂诱导hBMMSCs,用油红O和碱性磷酸酶染色分别检测各组hBMMSCs成脂及成骨分化能力。(2)衰老染色检测:使用衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法观察各组hBMMSCs的衰老变化。(3)氧化损伤检测:检测各组hBMMSCs胞内总抗氧化能力、总SOD含量、总谷胱甘肽过氧化物酶活力、MDA和ROS含量。(4)炎症因子检测:使用ELISA检测各组hBMMSCs培养上清液中的IL-2、IL-6和TNF-α的水平。(5)RT-PCR检测:各组hBMMSCs衰老相关基因P53、P21 m RNA水平的表达。结果:1.流式细胞术检测结果显示hBMMSCs表面抗原高表达CD73和CD90,也表达CD11b,但低表达CD19、CD14、HLA-DR,具有成脂、成骨分化能力,符合国际细胞学会对于间充质干细胞的定义。2.青年组、中年组、中老年组和老年组hBMMSCs随着年龄增长,其增殖能力、成骨分化能力逐渐减弱,但成脂分化能力逐渐增强;SA-β-Gal染色阳性的hBMMSCs数逐渐增多,周期发生阻滞,凋亡率逐渐增加;胞内MDA及ROS含量逐渐增加,总抗氧化能力、SOD及总谷胱甘肽过氧化物酶活力逐渐降低;炎症因子IL-6和TNF-α水平逐渐升高,IL-2水平逐渐减低。3.RT-PCR结果显示:hBMMSCs衰老相关p53和p21 m RNA表达水平随着年龄增加而上调。结论:1.随着年龄的增加,hBMMSCs发生了衰老生物学变化,表现为增殖能力降低,成骨分化能力减弱,衰老阳性细胞数增多等。2.hBMMSCs随着年龄的增加发生衰老变化的其机制可能与氧化应激损伤水平增高,炎症因子分泌增多,P53/P21通路激活等有关。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R339.38

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