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《重庆医科大学》 2017年
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多抗用于快速比较未纯化酶/突变体的比活性

冯一然  
【摘要】:酶的分子工程是生物技术领域研究的焦点,目前主要包括合理设计和定向进化。突变体的合理设计需要建立在了解酶的活性-构效关系的基础上,不仅在技术上具有挑战性,而且需要巨大的计算量;因此,通过建立起始酶突变体文库的定向进化更常用。理论上来讲,纯化后突变体比活性的比较可以用于识别阳性突变体,但是突变体数量巨大,纯化过程的成本和时间消耗极大地阻碍了筛选效率。在诱导表达后,希望借助细胞裂解液中酶与突变体比活性的比较识别阳性突变体,但不同单克隆诱导表达丰度差异巨大。显然,酶的定向进化需要能可靠识别阳性突变体的新策略。在前期实验基础上,利用固定在微板孔的抗6His单抗与羧酸酯酶(Est1)及其突变体M326L,以及使用Ni2+-NTA磁性颗粒与大肠杆菌碱性磷酸酶(ECAP)及其突变体R168K,已经被证明可有效预测Vs以识别阳性突变体,该方法已获得专利。不幸的是,微孔板固定单抗其应用范围窄,亲和力不够,抗His标签的单抗适合于预测6His标记Est1/突变体的Vs,而对6His标记的ECAP和6His标记的铜绿假单胞菌芳香族硫酸酯酶(PAAS)都是无效的;此外,Ni2+-NTA磁性颗粒会抑制PAAS/突变体酶的活性,且抑制作用对不同突变体不一致,其对细胞裂解液中酶丰度的要求也较高。因此,在前期已有方法学的基础上,考虑将多抗作亲和吸附剂,其结合反应的亲和力、适用范围、成本、耗时等方面均有所改进。1.微孔板固定硫酸铵沉淀粗制多抗比较未纯化酶/突变体的Vs重组表达并亲和纯化6His-ECAP及6His-PAAS使其纯度达85%以上,生理盐水稀释纯样品并与弗氏免疫佐剂乳化作为免疫原,注射5次取全血分离血清得相应抗血清,将抗ECAP兔抗血清用33%的硫酸铵沉淀得粗制多抗,再用p H6.0的MES缓冲液在DEAE-纤维素柱中纯化得到纯化多抗。在前期研究基础上,将粗制多抗固定在96孔ELISA板中,ECAP及突变体R168K诱导表达后的细胞裂解液作为样品,测得活性及蛋白浓度后,再应用响应曲线拟合的方法对吸附的酶/突变体进行定量活性比较。4.0ml培养体积诱导表达后的样品裂解液中,ECAP的活性达19.7±5.7 KU/g(n=12),而R168K的活性为36.7±15.1 KU/g(n=12)。其活性比率比亲和纯化两次后用传统方法测得比率大得多(P0.01)。使用相同批次的ECAP粗制多抗,通过Matalab拟合ECAP与R168K响应曲线估计Vs的比率为1.6±0.1(n=2),通过回归分析得到的比率为1.5±0.1(n=2)。通过两种数据处理方法,ECAP与突变体R168K关于Vs比率彼此一致,并与亲和纯化后用传统方法测定或使用Ni2+-NTA的预测Vs的比率一致,支持了多抗作为亲和吸附剂预测Vs可靠性。2.磁珠固定纯化多抗预测比较未纯化酶/突变体的Vs抗ECAP或PAAS抗血清通过33%硫酸铵沉淀和DEAE-纤维素柱得到纯化多抗;磁珠羧基活化后固定纯化多抗备用;在固定有多抗的磁珠中加入对应酶进行免疫反应,洗去未结合酶,加入对硝基苯酚衍生物类底物显色,强碱终止反应后读取405 nm处吸收增量表示吸附酶活性,对反应体系中加入的总蛋白量可绘制响应曲线,据吸附反应的数学模型拟合响应曲线预测Vs。假定吸附酶与游离酶比活性相同,每克多抗磁珠吸附酶容量约2.0 mg。R168K较ECAP的比活性提高约50%,2.5μg多抗磁珠反应10 min用于预测Vs;PAAS与活性仅低于其25%的突变体G138S,需要10μg多抗磁珠反应20 min预测Vs,而ECAP的酶活力是PAAS的70倍。因此,只要被吸附酶活性能在仪器的检测限内可靠测定,用磁珠能识别活性提高20%以上的弱阳性突变体,故磁珠固定多抗的方法适于预测Vs以识别弱阳性突变体。3.免疫比浊法预测未纯化酶/突变体比活性使用PAAS和芽孢杆菌致病尿酸酶(BFU)及其突变体作为模型,测试了基于蛋白层面的免疫比浊(ITA)测定细胞裂解液中酶及突变体的量以获得其比活性。以0.18m L含有0.75mg抗血清的反应缓冲液与0.02m L梯度稀释样品液为固定反应体系,使用酶标仪测定340nm与700nm处的吸光度值。根据ITA的校准曲线在0.4至3.0μg范围内对PAAS或BFU进行定量。在相同诱导表达条件下,批间重复时细胞裂解液中PAAS/突变体的表达丰度基本一致,保证了细胞裂解液中酶/突变体对相同抗血清存在一致的免疫反应性;BFU/突变体的表达丰度与PAAS呈现相同趋势。细胞裂解液中PAAS/突变体或BFU/突变体通过ITA后得到免疫比活性的比值与纯化后常规测定方法测出的比活性比值高度一致。为了识别活性仅高PAAS比活性50%的突变体,48孔微量培养板诱导表达相应酶及其突变体,通过ITA测定并进行ROC曲线分析发现,ITA给出的曲线下面积比活性浓度及表观比活性的ROC曲线下面积高得多。因此,通过ITA对细胞裂解液中酶/突变体的测定有希望获取酶及其突变体的特异比活性以用于阐明序列-活性关系和识别阳性突变体。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q814

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