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《重庆医科大学》 2017年
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标签GST亲和标记试剂的设计、合成及表征

夏超  
【摘要】:日本血吸虫GST(sjGST,26kDa)是一种常用的融合蛋白标签。基于融合表达标签sjGST的亲和标记是位点选择性固定化融合表达蛋白的重要策略。sjGST是同二聚体,具有两个活性中心且含两个大体积疏水结合位点,设计能同时封闭两个疏水结合位点的标记试剂,经磁珠偶联并固定化融合靶蛋白,有望用于磁珠固定化靶蛋白联合磁分离和液相色谱快速分离筛选混合物中未知含量高亲和力候选配体。首先,基于sjGST二聚体的双活性中心及活性中心附近的半胱氨酸残基,以双苯环为疏水定位基,衍生卤代乙酰基为巯基修饰基,得到单价不可逆标记试剂(Br-Ⅰ);用柔性链连接单价不可逆标记试剂,得二价不可逆亲和标记试剂(Br-Ⅱ):标记试剂在sjGST作用下与GSH生成亲和力更高的产物,即为sjGST可逆标记试剂。经酶学表征后,偶联于磁珠表面固定化GST,表征其动力学、固定化容量、稳定性、特异性、及非特异结合。设计探索了多条合成路线,最终确定了以对甲氧基苯酚为原料,通过N-乙基甘氨酸与对溴乙酰氨基苯甲酸相连,得到含羧基末端为偶联基团的单价标记试剂Br-Ⅰ,可与氨基磁珠偶联;再通过二乙烯三胺连接得到含氨基末端为偶联基团的对称二价标记试剂Br-Ⅱ,可偶联羧基磁珠;并经~1H-NMR、~(13)C-NMR和HRMS进行结构确认。测定在等量和100倍量Br-Ⅱ存在下酶活性对时间响应曲线计算反应速度常数分别为0.00783 min~(-1),0.236 min~(-1);Br-Ⅱ对sjGST表观抑制常数达微摩尔级;测定酶活性对Br-Ⅱ的浓度响应估算结合比为1:1;其与GSH生成的产物对sjGST表观抑制常数达微摩尔级。经变性SDS-PAGE发现Br-Ⅱ标记sjGST时未出现二聚体状态,故Br-Ⅱ本身可能并未同时与两个活性中心的氨基酸残基进行共价标记。通过Br-Ⅱ连接臂上氨基与羧基磁珠DCC脱水偶联后不可逆固定化sjGST,及在GSH存在下可逆固定化sjGST。测定过量Br-Ⅱ不可逆固定化达到稳定时间约为6 h且高温煮沸不脱落,固定化容量约为24±2μg/g;过量Br-Ⅱ可逆固定化达到稳定时间约为45 min,固定化容量约为26±2μg/g,延长1.5 h稳定;对碱性磷酸酶非特异结合可忽略;用疏水荧光底物表征固定化后对于小分子的非特异吸附,发现不可逆固定化磁珠有一定非特异吸附,但经Br-Ⅰ和GSH再次处理可减少非特异吸附;可逆固定化更快、非特异吸附小、且稳定性也满足筛选要求。由于后处理对Br-Ⅰ偶联磁珠标记固定化sjGST应该适用,且Br-Ⅰ更易合成,故进一步表征Br-Ⅰ。Br-Ⅰ与氨基磁珠DCC脱水偶联;在等量和100倍量Br-Ⅰ存在测定酶活性对时间响应曲线计算反应速度常数,分别为0.01074 min~(-1)和0.205 min~(-1);Br-Ⅰ与sjGST活性位点的结合比为2:1,Br-Ⅰ对sjGST表观抑制常数达微摩尔级,其与GSH生成的产物对sjGST表观抑制常数达微摩尔级。通过羧基与氨基磁珠DCC脱水偶联后对sjGST不可逆固定化,及在GSH存在下对sjGST可逆固定化。不可逆固定化时间约为5-6 h且高温煮沸不解离,固定化容量约为25±2μg/g;可逆固定化时间约为45 min,固定化容量均约为28±2μg/g;对碱性磷酸酶非特异结合可忽略;不可逆固定化对小分子有一定非特异吸附,但经再次处理后可减少。综上所述,Br-Ⅱ与Br-Ⅰ都能不可逆固定sjGST,固定化容量相近,不可逆标记需用单价标记试剂再处理以减少对小分子非特异结合。单价标记试剂合成更简单,产率更高。不可逆固定sjGST用Br-Ⅰ更有优势。Br-Ⅱ可逆固定化更快且稳定性满足筛选要求。因此,利用廉价双苯环结构为疏水定位基和溴乙酰基为活性中心附近巯基修饰基团,设计sjGST不可逆亲和标记试剂并尽可能封闭二聚体中双疏水位点,获得带偶联基团的sjGST二价标记试剂,并初步证明可应用于sjGST的固定化。此标记策略有望用于sjGST融合表达靶蛋白的位点选择性固定化。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q81

【参考文献】
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