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《重庆医科大学》 2017年
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双酶融合表达用于筛选突变体库

种慧敏  
【摘要】:起始酶及其突变体作为目标酶与标签酶融合表达,检测在细胞裂解液中目标酶与标签酶活力并计算其活力比值用于比较是更高效可靠的酶突变体高通量(HTP)筛选策略。适合的标签酶应满足:多肽链一端位于酶活性中心以外从而便于与目标酶融合表达,其酶活性在未转化宿主细胞裂解液中很低故本底很低,融合后对目标酶活力几乎没有影响或对起始酶及其突变体活力产生相同比例的影响;适用的目标酶要求其多肽链一端在活力中心之外以便与标签酶融合表达。碱性磷酸酶和芳香硫酸酯酶有重要应用,且二者的活性能在微孔板中单通道同步测定。本文以大肠杆菌碱性磷酸酶(ECAP)为标签酶置于融合蛋白N端,以铜绿假单胞菌芳香硫酸酯酶(PAAS)为目标酶且置于融合蛋白C端,中间以中性柔性短肽连接。于PAAS M72位进行定点饱和突变建立一个小规模突变体库,用碱裂解方法在微孔板中裂解细胞制样,用酶标仪检测两酶活力并计算PAAS及其突变体与ECAP的活性比值。PAAS及其三个突变体在融合表达时都出现了降解的蛋白片段,但在细胞裂解液中,PAAS及其突变体与ECAP活力比值的相对值与未融合酶/突变体纯化后比活的相对值成正比,这种比较活力比值的方法能够更好地识别弱阳性突变体,即使非融合酶/突变体之间纯化后比活性比值接近1.50时,比较融合酶中两种酶活性相对值识别阳性突变体时,ROC分析所得曲线下面积AUC也能高达0.995,如果仅比较其细胞裂解液中的酶活性则ROC分析的AUC小于0.83。此方法可以高通量筛选突变体库中高活力的突变体、快速确定目标酶的活性序列关系。这种新的方法只需要寻找对于目标酶来说适合的标签酶,此筛选策略在高通量筛选方面具有巨大潜力。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78

【参考文献】
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【共引文献】
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【二级参考文献】
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1 陈小军;王洋;屈浩;葛新顺;左玉丰;廖晓龙;;抗人CD33单链抗体的基因构建、表达及其生物活性检测[J];细胞与分子免疫学杂志;2007年12期
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