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《重庆医科大学》 2017年
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miR-155在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的作用及机制研究

刘红霞  
【摘要】:目的:研究miR-155在BMP9诱导成骨分化过程中的表达情况,探究miR-155对BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的调控作用,并对其相关调控机制进行初步研究。方法:用BMP9腺病毒诱导C2C12和MEF细胞成骨分化,q RT-PCR检测miR-155在成骨分化的0d,1d,3d,5d,7d的表达水平,并同时检测成骨相关标志物Runx2和ALP的表达,对BMP9诱导的成骨分化进行验证。miR-155模拟物过表达或miR-155抑制剂抑制miR-155的表达后通过ALP染色及活性检测其对成骨分化早期的影响,茜素红S(Alizarin Red S,ARS)染色观察其对BMP9诱导的成骨分化晚期的影响。q RT-PCR检测成骨相关标志物Runx2,OSX,ALP和OCN的表达,从基因水平检测miR-155对BMP9诱导的成骨分化的作用。Western blot检测Runx2,p-Smad1/5/8的表达,以及晚期成骨标志物OCN和OPN的表达。生物信息学分析miR-155潜在靶基因,在众多靶基因中选择与BMP9诱导成骨分化作用密切相关的Runx2和BMPR2进行分析,用q RT-PCR和Western blot检测miR-155对其潜在靶基因的调控,荧光素酶报告基因实验对miR-155与靶基因的直接靶向作用进行验证。干扰其靶基因后q RT-PCR检测成骨相关标志物的表达,探究靶基因在miR-155对BMP9诱导的成骨分化作用中的影响。裸鼠皮下异位成骨以后取异位骨进行micro CT扫描以及切片后进行HE染色和Masson染色体内验证miR-155对成骨分化的影响。结果:在BMP9诱导C2C12和MEF细胞成骨分化过程中,miR-155的表达呈现出一个先升高后降低的趋势。过表达miR-155后,细胞的ALP染色减弱,活性减低,ARS染色减弱。q RT-PCR检测结果显示在BMP9诱导的成骨分化过程中,过表达miR-155显著降低Runx2,OSX,ALP和OCN的表达,而抑制miR-155以后,其对成骨分化相关基因表达的抑制作用消失。Western blot结果显示miR-155能显著抑制Runx2和p-Smad1/5/8的表达,并能显著降低晚期成骨标志物OCN和OPN的表达。q RT-PCR结果显示miR-155对其潜在靶基因Runx2和BMPR2的m RNA影响不大,但Western blot结果显示miR-155能显著降低Runx2和BMPR2的蛋白表达水平。荧光素酶报告基因结果指出miR-155能直接靶向于Runx2和BMPR2,分别干扰Runx2和BMPR2后,q RT-PCR检测成骨相关标志物,结果显示干扰了靶基因后,成骨相关标志基因表达显著降低,与过表达miR-155作用相似。裸鼠皮下异位成骨后取异位骨组织micro CT扫描,结果表明miR-155能抑制BMP9诱导MEF细胞皮下成骨的体积和密度,HE染色和Masson染色结果显示miR-155能抑制异位骨的骨组织成熟度。结论:体内外实验结果证明miR-155能够抑制BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化,其可能是通过抑制Smad/BMP信号通路发挥作用。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R329.2

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