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《重庆医科大学》 2017年
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低频低强度超声介导质粒转入大肠杆菌及耻垢分枝杆菌的实验研究

郑慧敏  
【摘要】:研究意义超声促进基因转化或转染是一种新兴的方法,超声介导转化具有生物损害小、操作方法简便等优点,在医疗生物学科方面备受关注。同时,超声转化可以在同一实验条件下完成大样本的实验,在工业生产中也具有其独特的优势。目前,超声介导基因转化的研究主要集中在革兰阴性杆菌,如大肠杆菌、具核梭杆菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌,且对转化条件的研究多为单一指标观察。本文选用基因转化中最常用的革兰氏阴性杆菌大肠杆菌DH5α和细胞壁结构特殊的耻垢分枝杆菌作为基因转化的受体菌,通对超声介导基因转化进行多指标对比研究,希望建立低频低强度超声(Low-frequency and Low-intensity Ultrasound,LFLIU)介导质粒DNA转入细菌便捷、高效、安全的方法。在未来的发展中,超声促进基因转化可能是成为一种有前途的基因治疗的辅助技术。目的探讨不同剂量的LFLIU,以及LFLIU联合微泡等,介导质粒转入不同细菌的转化效率的影响,以及在基因和蛋白水平观察LFLIU辐照后对目的基因Clp P2表达情况的影响。方法1.LFLIU介导质粒转入大肠杆菌的效果观察:用42 k Hz超声辐照大肠杆菌DH5α和质粒DNA混合液,实验条件分别为:(1)以0.5mmol/L CaCl_2溶液为超声介质,采用0.13 W/cm~2超声分别连续超声辐照0 s、20 s、40 s、80 s、160 s、320 s;(2)分别以无菌生理盐水(不含有Ca2+)、0.5 mmol/L CaCl_2、1 mmol/L CaCl_2、5 mmol/L CaCl_2、10mmol/L CaCl_2溶液为超声介质,采用0.51 W/cm~2超声辐照连续辐照160s;(3)以0.5 mmol/L CaCl_2溶液为超声介质,连续超声辐照160 s,超声辐照强度分别为0 W/cm~2、0.13 W/cm~2、0.35 W/cm~2、0.51 W/cm~2、0.72 W/cm~2。观察指标:(1)比较不同实验条件对质粒转化效率的影响;(2)琼脂糖凝胶电泳检测不同声强对质粒构型的影响;(3)流式细胞仪检测不同声强对大肠杆菌存活率的影响。2.LFLIU联合微泡促进质粒转入耻垢分枝杆菌的效果观察:用40k Hz、0.27W/cm~2超声辐照耻垢分枝杆菌和外源物质混合液,Sonovue?微泡浓度分别为:0 mg/ml、1.25 mg/ml、2.5 mg/ml、3.75 mg/ml,LFLIU联合Sonovue?辐照的时间分别为:0 min、3 min、5 min、10 min、20 min。实验后观察:(1)比较不同条件下质粒的转化效率;(2)菌落计数法检测不同条件对耻垢分枝杆菌存活率的影响;(3)共聚焦显微镜观察LFLIU辐照后转入细菌的Dextran-FITC荧光情况;(4)扫描电镜观察超声辐照后耻垢分枝杆菌的显微结构;(5)q-PCR与Western blot分析分别在基因水平和蛋白水平,鉴定LFLIU辐照后对目的基因Clp P2表达情况影响。结果1.LFLIU能够介导质粒转入大肠杆菌DH5α及耻垢分枝杆菌,并在抗性培养板上筛选出阳性菌株,其质粒的转化效率与超声辐照强度、超声辐照时间、CaCl_2介质的浓度有一定关系。2.当LFLIU联合Sonovue?作用于耻垢分枝杆菌时,质粒的转化效率最高为19.33×10~2CFU/μg DNA,是单独超声作用下的19倍。3.电泳检测结果显示,随着超声辐照剂量的增强对质粒的构型有一定影响,在声强为0.72 W/cm~2对质粒构型的影响最为严重,可见超螺旋质粒结构变成开环状态,但不影响其结构的完整性。4.扫描电镜观察示单独超声辐照后细菌损伤较小,超声联合微泡后对超声有一定损伤,造成细菌肿胀、细胞壁断裂,菌体液化死亡等。5.q-PCR结果显示在LFLIU辐照10min后,可见Clp P2可以成功表达。Western blot分析结果显示LFLIU辐照后的阳性克隆可以成功表达目的基因Clp P2编码的蛋白。结论LFLIU能够介导质粒转入细菌,LFLIU联合微泡能显著提高质粒的转化效率。随着LFLIU辐照强度的增加,导致质粒构型改变,但不影响其结构的完整性。LFLIU辐照后目的基因Clp P2在基因水平和蛋白水平能够成功表达。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78

【参考文献】
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