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《重庆医科大学》 2017年
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γ-氨基丁酸对小鼠早期胚胎植入的毒性作用及机制研究

田娜  
【摘要】:哺乳动物受精后,受精卵经历一系列分裂和形态发生形成囊胚,参与母体子宫内膜的信息交流以启动胚胎植入。成功的胚胎植入取决于两个关键因素:即具有着床能力的囊胚和子宫内膜容受性同步进行,任何影响囊胚形成以及子宫内膜容受性的因素均能影响胚胎植入。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是中枢神经系统重要的抑制性神经递质,与相应受体特异性结合发挥生理功能,如降血压,抗焦虑,改善睡眠和提高记忆力等。相关研究发现在外周组织,如肝脏、胰腺、子宫、卵巢和胎盘等也有GABA存在,参与细胞间的信号传递及内分泌调节。在生殖系统,相关研究发现GABA在输卵管组织中的浓度高达4438 nmol/g,约是大脑含量的2倍,此外,课题组前期的研究表明GABA在小鼠妊娠D1-D4子宫中呈动态表达,并且参与小鼠子宫内膜蜕膜化和胎盘形成,提示GABA在小鼠妊娠过程中可能扮演关键作用。目前,GABA作为一种新的食品添加剂,广泛用于各种食品和保健品中,但不同产品GABA的推荐剂量差别很大,从几百毫克至几克不等。然而,目前尚无有关GABA生殖毒性的研究。本研究以妊娠小鼠为模型,首先给予妊娠小鼠不同剂量的GABA处理,探究GABA对小鼠子宫内膜容受性的毒性影响;随后在早期胚胎培养液中添加不同浓度的GABA干预,探究GABA对植入前胚胎发育的影响,从而阐明GABA对小鼠早期胚胎植入的毒性影响及其可能的作用机制。第一部分γ-氨基丁酸对妊娠小鼠子宫内膜容受性的毒性作用目的:探讨GABA对小鼠子宫内膜容受性的毒性作用。方法:1.妊娠D1小鼠被随机分为4组(每组15只),在妊娠D1-D5,分别给予6.4、10.0、12.5 mg/g GABA灌胃处理,对照组则给予相同体积的生理盐水处理。妊娠D5,尾静脉注射0.03%台盼蓝溶液,观察各处理组胚胎植入位点数的变化;2.收集各处理组妊娠D4小鼠子宫组织,制作石蜡切片(5μm),HE染色观察小鼠子宫形态结构的变化;3.Western blot和q PCR妊娠D4小鼠子宫内膜容受性标志因子E-cadherin,HOXA10和LIF的m RNA和蛋白表达水平,并通过ELISA测定子宫中IL-6的水平;4.放射免疫分析法测定小鼠血清中雌二醇(E2)和孕酮(P4)的含量。结果:1.12.5 mg/g GABA处理组小鼠胚胎植入位点数较对照组显著降低(10.5±3.5 vs.13±2.2,P0.05);2.HE染色结果显示,和对照组相比,12.5 mg/g GABA处理后小鼠子宫结构发生异常,子宫内腺体数显著减少(P0.05);3.与对照组比较,12.5 mg/g GABA处理组小鼠子宫内膜容受性标志因子E-cadherin,LIF,HOXA10的m RNA和蛋白表达均显著下调(P0.05),同时各GABA处理组小鼠子宫组织中IL-6的含量均显著低于对照组(P0.01);4.12.5 mg/g GABA处理组血清雌二醇(E2)和孕酮(P4)的水平较对照组也显著降低(P0.05)。结论:高浓度GABA(12.5 mg/g)能够损害妊娠小鼠子宫内膜容受性。第二部分γ-氨基丁酸对小鼠植入前期胚胎发育的毒性作用及机制目的:探究GABA对小鼠植入前胚胎发育的毒性作用及其可能的机制。方法:1.收集各发育阶段的小鼠植入前胚胎,通过激光共聚焦检测GABA及其B受体B1亚基(GB1)、A受体pi亚基(GABRP)以及GABA合成酶(GAD67)的表达;2.不同发育阶段的胚胎分别培养在含10、20、30、40、50μg/μl GABA的培养液中,48-72h时观察囊胚的形成并计算囊胚形成率;3.给予40μM B型受体抑制剂(2-hydroxysaclofen)预处理2细胞胚胎1-2 h,再分别给予30和40μg/μl GABA处理,72h时观察囊胚的形成情况。结果:1.GABA与其受体GB1蛋白在小鼠植入前胚胎中的表达模式一致,在2细胞和4-细胞阶段,主要定位在细胞膜上,而在8-细胞至囊胚阶段,则定位到细胞核中;而另一受体GABRP在植入前胚胎的各个阶段均不表达。2.各发育阶段胚胎的囊胚形成率均随着GABA浓度的增加而下降,且呈剂量依赖性;10μg/μl GABA可显著降低2-细胞胚胎的囊胚形成率(92%vs.99%,P=0.017)。3.40μM 2-hydroxysaclofen能够有效逆转30μg/μl和40μg/μl GABA对囊胚形成的抑制作用(45%vs.99%,P=0.000;4%vs.99%,P=0.000)。结论:GABA通过其B受体,介导了对植入前胚胎发育的毒性作用。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q132

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