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《重庆医科大学》 2016年
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转录因子Foxa2在子宫内膜异位症发病中的作用及机制研究

林安平  
【摘要】:子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)是一种常见的妇科良性疾病,指具有生长功能的子宫内膜出现在子宫腔被覆粘膜以外的身体其他部位。EMs的发病学说众多,但对其真正的原因尚无定论,与正常人的子宫内膜比较,EMs患者异位病灶的基因发生了明显的变化。我们在前期研究中,通过生物信息学方法,发现了一些新的在EMs发生中起作用的关键转录因子,它们调控了其他关键转录因子,同时也被其他重要转录因子所调控。我们前期实验已经验证了其中一个关键转录因子Foxa2在EMs中存在差异表达。叉头框蛋白A2(Foxa2)属于FOX家族成员,所编码的转录因子Foxa2在细胞生长、增殖、分化过程中发挥着重要的作用。研究显示,Foxa2与许多性激素依赖性肿瘤有密切关系,雌激素受体1(ERa)和雄激素受体(AR)被募集到其靶基因时必须依靠Foxa2,Foxa2作为ERa和AR的共调节因子而发挥作用。因此,在性激素依赖性疾病中,Foxa2在雌激素和雄激素信号通路中发挥了及其重要的作用。子宫内膜异位症是雌激素依赖性疾病,异位内膜的生长和侵袭依赖于性激素,而性激素要与其相应的受体结合后才能起作用,性激素受体水平的上调或下调与性激素及相关细胞因子有关。基于Foxa2与雌激素受体(ER)的密切关系,我们在本课题中将通过免疫组织化学、QPCR、Westren blot等方法研究Foxa2在子宫内膜异位症中表达变化并通过雌孕激素刺激及sh-RNA干扰技术探讨Foxa2对子宫内膜间质细胞的影响及其相应机制。第一部分:Foxa2在子宫内膜异位症组织中的表达目的:明确Foxa2蛋白及基因在正常子宫内膜、内异症在位内膜、内异症异位内膜、早孕期蜕膜等组织中表达情况。方法:获取新鲜正常子宫内膜及子宫内膜异位症在位内膜和异位内膜标本、早孕期蜕膜组织及绒毛组织。采用QPCR、免疫组织化学、免疫组织荧光、Western blot等方法检测Foxa2在正常子宫内膜、内异症在位内膜、内异症异位内膜、早孕期蜕膜等组织中表达情况。结果:免疫荧光及免疫组化结果显示:Foxa2在正常子宫内膜表达高于异位内膜组织。QPCR及Western-blot显示:各组Foxa2的表达子宫内膜子宫内膜异位内膜(P0.05)。正常子宫内膜分泌期较增生期表达显著增强(P0.05),在位内膜与异位内膜组织中增生期与分泌期Foxa2的表达量无显著性差异(P0.05)。Foxa2在不同孕龄蜕膜及绒毛组织中的表达量,随着妊娠时间的增加,表达明显增加。结论:1、Foxa2在正常子宫内膜、子宫内膜异位症在位内膜、异位内膜均有表达;Foxa2在子宫内膜异位症的异位内膜组织中表达降低。2、在正常子宫内膜中,Foxa2在分泌期较增生期表达增加;而在内异症在位内膜和异位内膜的分泌期与增生期中表达差异无显著性。3、在早孕期蜕膜及绒毛组织中,Foxa2表达均随着妊娠时间的增加表达显著增加。第二部分:雌孕激素对人子宫内膜间质细胞Foxa2表达的影响目的:研究雌孕激素对人子宫内膜间质细胞Foxa2表达的影响方法:体外原代培养人子宫内膜间质细胞并进行细胞鉴定,分别用不同浓度的雌激素、孕激素及雌孕激素联合刺激,分别检测各组细胞Foxa2 mRNA表达的变化。结果:1、细胞培养与鉴定:免疫细胞化学结果显示,人子宫内膜间质细胞波形蛋白呈阳性,细胞角蛋白呈阴性。记数波形蛋白染色阳性细胞数,结果显示本研究分离得到的内膜间质细胞纯度达90%-95%。2、雌激素刺激后,Foxa2 mRNA的表达较正常对照组明显增加;在由低浓度(10~-99 mol/L)增加时,Foxa2表达增加;但达到一定浓度时(10~(-8)mol/L),继续增加雌激素浓度(10~(-7) mol/L),Foxa2表达受到一定抑制。高浓度孕激素抑制Foxa2表达,但在低浓度时,Foxa2表达较正常对照组稍升高。雌孕激素联合刺激时,Foxa2表达较正常对照组升高,但较雌激素组低。结论:雌孕激素均对子宫内膜间质细胞Foxa2表达有影响,雌激素可增强Foxa2的表达,其表达随E2浓度的变化有差异。高浓度孕激素抑制Foxa2的表达,较低浓度时,抑制作用不明显。第三部分:Foxa2对子宫内膜间质细胞的细胞生物学行为影响目的:研究Foxa2对子宫内膜间质细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等细胞生物学行为影响。方法:合成Foxa2的siRNA,筛选抑制率最高的用于进一步实验。转染原代培养的人子宫内膜间质细胞,通过PCR和Western blot验证抑制效率。通过MTT、流式细胞、划痕、transwell等实验检测Foxa2的对子宫内膜间质细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等细胞生物学行为影响。分别用雌孕激素刺激后,再次通过MTT、流式细胞、划痕、transwell等实验检测Foxa2的功能。结果:经转染质粒后,QPCR及Western-blot显示Foxa2的mRNA和蛋白均明显抑制。抑制Foxa2的表达后,细胞增殖、迁移、侵袭能力增强,细胞凋亡减少;抑制Foxa2后,在雌激素刺激下,细胞增殖、迁移、侵袭能力增加而细胞凋亡减少,较单纯雌激素刺激作用更强;在孕激素刺激下,细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡能力与对照组无显著性差异。结论:抑制Foxa2后,子宫内膜间质细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显增强,而凋亡减少。雌激素与si-RNA Foxa2有协同作用,能更进一步增强子宫内膜间质细胞的增殖、迁移、侵袭能力。第四部分:Foxa2在子宫内膜异位症中下调的机制研究目的:研究Foxa2在子宫内膜异位症中下调的机制方法:原代培养人子宫内膜间质细胞,使用TNF-α处理细胞,细胞免疫荧光检查细胞Foxa2表达及细胞内定位,Western blot检测IKK-α及Foxa2的表达;使用IKK-α特异性阻断剂及TNF-α处理细胞后再次检测Foxa2的表达。结果:1、正常组子宫内膜间质细胞Foxa2表达于细胞核,细胞浆中表达较少。TNF-α处理人子宫内膜间质细胞24小时后,Foxa2蛋白主要聚集于细胞核膜周边及细胞浆中。2、用Western Blot结果显示:TNF-α刺激后,人子宫内膜间质细胞Foxa2蛋白表达降低,而IKK-α蛋白表达增加。使用IKK-α蛋白特异性阻断剂后,用TNF-α处理24小时后,人子宫内膜间质细胞Foxa2蛋白表达与正常对照组相比差异无显著性。结论:TNF-α处理人子宫内膜间质细胞后,使Foxa2细胞定位发生转位,失去核定位能力并转入细胞浆中,胞浆中的Foxa2被降解而使Foxa2蛋白表达降低。TNF-α对Foxa2蛋白表达的降低是通过IKK-α来实现的。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R711.71

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