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《重庆医科大学》 2018年
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锌-α2-糖蛋白在癫痫形成分子机制中作用的研究

刘瑛  
【摘要】:第一部分ZAG在癫痫患者及癫痫动物模型脑组织中的表达目的:探究ZAG在难治性TLE患者皮质及PTZ点燃癫痫大鼠模型海马、皮质组织中的表达及其表达变化。方法:1.收集脑外伤患者手术切除的皮质为对照组(n=20),TLE患者行癫痫灶切除的皮质为癫痫组(n=14)。同时,建立PTZ大鼠癫痫模型(n=20),对照组大鼠腹腔注射生理盐水(n=20);2.运用免疫荧光双标技术研究颞叶癫痫患者和癫痫大鼠脑组织中ZAG的细胞定位。运用RT-q PCR、免疫组织化学及Western blot方法测定癫痫患者和癫痫大鼠脑组织中AZGP1 m RNA和ZAG蛋白表达量的差异;3.运用蛋白免疫印迹方法检测PTZ腹腔注射1天、1周、2周、3周和4周的大鼠脑组织中ZAG的蛋白表达量的变化情况。结果:1.免疫荧光染色结果显示,ZAG主要表达于人脑组织以及大鼠脑组织中的神经元胞质;2.RT-q PCR结果显示癫痫患者及癫痫大鼠脑组织中AZGP1的m RNA水平较对照组明显降低(P0.05);3.免疫组织化学染色和Western blot结果显示ZAG在癫痫患者以及癫痫大鼠模型中水平下降(P0.05);4.在癫痫模型大鼠脑组织中的ZAG表达水平随PTZ注射时间的延长呈进行性加重。结论:ZAG存在于脑组织中,且其可能是由神经元合成,而不是星形胶质细胞。AZGP1 m RNA及ZAG蛋白表达水平在TLE患者与癫痫大鼠模型脑组织中均下降。癫痫大鼠模型脑组织中ZAG蛋白水平与PTZ注射时间呈负相关。ZAG的下降可能在癫痫的发病机制及病理生理中具有重要作用。第二部分ZAG在癫痫发作中的作用机制目的:探索ZAG在癫痫中的可能作用机制。方法:1.验证AAV的转染效果:将成年雄性SD大鼠随机分为四个组(n=20):对照组(Control)、空病毒组(GFP)、AAV注射后3周组(AZGP1-3W)及、AAV注射后9周组(AZGP1-9W)。运用激光共聚焦显微镜观察、RT-q PCR及Western Blot分别检测AAV注射后3周及9周的转染效果;2.探索过表达AZGP1在PTZ大鼠模型中可能的作用机制:另取45只SD大鼠随机分为三个组:对照组(Control)、癫痫组(GFP+PTZ)及过表达病毒组(AZGP1+PTZ)。AZGP1+PTZ与GFP+PTZ组大鼠在AAV注射后3周起,每日接受PTZ腹腔注射共28天,Control组大鼠接受同等剂量的生理盐水腹腔注射。观察各组大鼠的行为学及脑电图(EEG)差异。运用Co-IP检测癫痫组大鼠脑组织中ZAG与p-ERK及ZAG与TGFβ之间是否存在相互结合。运用Western Blot检测各组之间大鼠脑组织中炎症因子TNFα,IL-6,TGFβ,ERK及p-ERK的表达变化情况。结果:1.AAV-AZGP1和AAV-GFP海马立体定位注射后,绿色荧光结果显示海马CA3区有GFP阳性表达。RT-qPCR及免疫印迹及结果显示,与相应时间点对照组相比,AZGP1过表达组AZGP1 m RNA及ZAG蛋白在病毒注射后第3周和第9周显著增加(P0.05);2.Co-IP结果显示ZAG可以与p-ERK及TGFβ结合;3.过表达AZGP1可以降低PTZ诱导的癫痫大鼠模型的癫痫发作评分,延长PTZ点燃的潜伏期,并缓解癫痫样放电的程度;4.过表达AZGP1可以减轻PTZ癫痫模型大鼠的脑组织中TNFα,IL-6,TGFβ水平的升高,并降低ERK的磷酸化水平。结论:ZAG可能通过与TGFβ及p ERK之间的相互作用参与癫痫发生。ZAG可能通过抑制TGFβ介导的ERK磷酸化以及TNFα和IL-6介导的神经炎症从而抑制癫痫发作。ZAG可能是治疗癫痫的潜在新靶点。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R742.1

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