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《重庆医科大学》 2018年
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pik3r1通过PI3K-AKT-mTOR通路影响小鼠子宫内膜的蜕膜化进程

倪明云  
【摘要】:目的:作为成功妊娠的关键环节,胚胎植入的顺利完成需要功能完整的囊胚与处于容受态的子宫内膜协同发挥作用。子宫内膜基质细胞的蜕膜化是胚胎植入的重要组成部分,但其机制尚不清楚。本文旨在探讨Pik3r1在小鼠子宫内膜蜕膜化过程中的作用及相关分子机制。方法:(1)建立小鼠正常妊娠模型,于妊娠第4天子宫角注射PI3K的抑制剂LY294002,妊娠第6天取材,观察抑制PI3K对胚胎植入的影响。(2)建立小鼠正常妊娠模型,利用免疫组织化学和Western Blot检测D1-D7子宫内膜组织中pik3r1的蛋白表达。(3)建立小鼠人工诱导蜕膜化模型,利用Western Blot检测pik3r1的蛋白表达水平。(4)分离原代小鼠子宫内膜基质细胞进行培养,借助免疫荧光检测基质细胞分子标志物波形蛋白的表达,观察原代子宫内膜基质细胞的纯度;利用pik3r1的siRNA转染和PI3K抑制剂LY294002处理细胞,通过Western Blot检测转染前后pik3r1的蛋白水平,观察转染效果,通过流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡水平,研究pik3r1对子宫内膜基质细胞的影响。(5)分离原代小鼠子宫内膜基质细胞进行培养,利用pik3r1的siRNA转染和PI3K抑制剂LY294002处理细胞后,加入E2、P4诱导子宫内膜基质细胞蜕膜化,利用定量PCR检测基质细胞蜕膜化标志物dtprp的mRNA水平,观察沉默pik3r1的表达和抑制PI3K活性对子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响。(6)利用Western Blot检测细胞增殖分子标志物PCNA和凋亡分子标志物BAX/BCL-2的蛋白水平,观察沉默pik3r1的表达和抑制PI3K活性对蜕膜化进程中子宫内膜基质细胞的影响;利用Western Blot对PI3K下游相关信号分子AKT/p-AKT/mTOR/p-mTOR/P70S6K/p-P70S6K的蛋白水平进行检测,初步揭示pik3r1影响子宫内膜基质细胞蜕膜化的分子机制。结果:(1)抑制PI3K活性后,小鼠胚胎着床数目显著低于对照侧。(2)pik3r1在小鼠早期妊娠子宫内膜的表达具有时空差异。其蛋白定位于子宫内膜基质细胞,而在蜕膜细胞呈现低表达,随基质细胞蜕膜化的进行表达显著降低。(3)与对照侧相比,pik3r1在人工诱导蜕膜化侧子宫内膜组织中的表达显著减少。(4)下调pik3r1的表达、抑制PI3K活性可使子宫内膜基质细胞的凋亡增加,细胞周期的S期百分比降低,PCNA的蛋白表达下降。(5)下调pik3r1的表达、抑制PI3K活性均可显著降低蜕膜化分子标志物dtprp的mRNA水平。(6)下调pik3r1的表达、抑制PI3K活性均可抑制PCNA的蛋白表达,上调BAX的蛋白表达、下调BCL-2的蛋白水平;同时下游信号分子AKT/mTOR/P70S6K的磷酸化水平降低。结论:Pik3r1通过PI3K-AKT-mTOR信号途径促进基质细胞增殖、抑制细胞凋亡,在小鼠子宫内膜蜕膜化进程中发挥重要作用,参与调控胚胎植入。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R714

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