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《重庆医科大学》 2019年
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次磺酸化蛋白的小分子荧光探针设计及活细胞原位显影

卢进鹏  
【摘要】:氧化应激与许多疾病的发生有密切的联系,尤其是阿兹海默病、帕金森式病等神经退行性疾病。氧化应激过程中,蛋白质巯基部分氧化生成次磺酸化蛋白,这是活性氧氧化蛋白质的关键中间产物。蛋白次磺酸官能团也可被还原成巯基,或继续氧化成亚磺酸和磺酸,当其被氧化成磺酸后,则难以逆转造成蛋白质的持续损伤。次磺酸化蛋白是机体和细胞感受氧化应激的重要瞬时标志物。因此,建立检测次磺酸化蛋白,尤其分析细胞内特定信号通路中对活性氧敏感蛋白的次磺酸化程度的方法,对于研究氧化应激调控机制和损伤修复机制非常重要。目前检测氧化应激中间产物次磺酸化蛋白常用免疫学方法,但灵敏度低。相反,小分子化学探针体积小而通用性更强。但目前应用小分子直接检测次磺酸化蛋白的方法较少。本文以8-氨基-1,3,6-萘三磺酸二钠盐作为荧光基团,氰基乙酸、3,5-环己二酮羧酸、(苯磺酰基)乙酸作为次磺酸反应基团,溴乙胺、对氨基苯甲酸作为连接基团设计合成了一系列荧光探针。表征其荧光光谱,及其温度、pH效应,以牛血清白蛋白经氧化生成次磺酸化蛋白模型,研究了探针标记后的荧光共振能量转移(FRET)效应,探针标记的选择性。进一步经肺癌上皮细胞A549在H_2O_2处理后标记显影筛选出最优探针8-(2-氰基乙酰胺基)-6-磺基萘-1,3-二磺酸钠(Probe-I)。评价Probe-I抗氧化还原能力、脂水分配系数,以A549和肺正常上皮细胞BEAS-2B为细胞模型,MTT测定探针的细胞毒性,优化细胞的显影条件,激光共聚焦检测细胞内标记显影及活细胞内的亚细胞定位。结果表明,Probe-I具有以下特点:1.在亲水环境中自身荧光很弱,与次磺酸化蛋白反应后荧光基团处于蛋白质结构内疏水环境才能产生较强荧光,其激发和发射波长分别为340 nm和520 nm,标记蛋白后可与蛋白内色氨酸发生荧光共振能量转移(FRET);2.对pH、温度不敏感,在pH=4~10及温度0~90℃范围内,荧光基本不发生变化;3.H_2O_2与二硫苏糖醇(DTT)对探针荧光光谱几乎无影响;4.荧光探针的脂水分配系数为LogP=0.1±0.03(n=3),具有较好的水溶性兼膜通透性。5.探针与次磺酸化白蛋白发生较强FRET效应,具有较强的灵敏度,不同离子与溶剂对探针标记次磺酸化白蛋白干扰较小。Probe-I在0~200μM范围内对肺癌细胞A549与正常人肺上皮细胞BEAS-2B无毒性,探针在两种细胞中标记的最佳条件分别为2 mM与1 mM H_2O_2氧化5min、100μM探针标记4 h;与商业化探针亚细胞器内共定位显影,发现探针标记主要发生在核仁上。综上,所设计的荧光探针能直接与次磺酸官能团反应,并与蛋白内色氨酸发生共振能量转移,从而有效识别次磺酸化蛋白,本底干扰小,且对pH、温度、氧化还原试剂的不敏感,脂水分配系数适当,能进入细胞核仁内原位显影次磺酸化蛋白。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R446;O657.3

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