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《重庆医科大学》 2019年
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PT8A关键氨基酸残基鉴定及其免疫佐剂活性研究

罗茹月  
【摘要】:我们的前期研究证实,八肽(HIDSQKKA,简称PT8A)分子融合到人轮状病毒(HRV)VP8~*抗原的C端具有粘膜和肌内佐剂的活性,是一个新发现的分子内免疫佐剂。PT8A来源于大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的T细胞表位和B细胞表位(78~85 aa)。本研究共构建了3个PT8A突变体在HRV VP 8~*亚单位疫苗的C末端与VP8~*基因融合。用分子内佐剂PT8A及其突变体融合的VP8~*蛋白对雌性Balb/c小鼠进行滴鼻免疫,并用间接ELISA法检测血清IgG水平。VP8-CgR5和VP8-ChR8突变株的血清特异性IgG水平均显著高于原株VP8-PT8A。结果表明,PT8A中Q5和A8的氨基酸突变增强了PT8A的粘膜佐剂活性,PT8A的突变S4对PT8A的佐剂活性无影响。目的:PT8A突变型与PT8A的免疫佐剂活性比较研究,筛选免疫佐剂活性增高的突变型,初步鉴定PT8A的关键氨基酸残基。方法:1.使用2×PCR premix Taq(Ex Taq Version 2.0)酶通过PCR扩增PT8A得到突变基因片段VP8-CgR4、VP8-CgR5和VP8-ChR8;2.构建pET32-VP8-CgR4、pET32-VP8-CgR5和pET32-VP8-ChR8,通过PCR检测目的基因片段是否连入载体后送测序;3.表达融合蛋白VP8-CgR4、VP8-CgR5和VP8-ChR8,采用His标签纯化蛋白后用TGE复性,PGE8000浓缩至1mL,再用10%SDS-PAGE检测蛋白大小;4.将浓缩好的蛋白去除内毒素;5.滴鼻免疫Balb/c雌性小鼠;6.收集血清;7.采用间接ELISA法测定血清特异性抗体IgG水平。结果:1.成功构建pET32a-VP8-CgR4、pET32a-VP8-CgR5和pET32a-VP8-ChR8突变型重组质粒;2.融合蛋白VP8-PT8A、VP8-CgR4、VP8-CgR5和VP8-ChR8成功表达和纯化,经10%SDS-PAGE检测,蛋白大小在40KD左右;3.间接ELISA检测结果表明,VP8-CgR5组和VP8-ChR8组的VP8~*特异性IgG滴度显著高于VP8-PT8A组(P0.05),而VP8-CgR4组与VP8-PT8A组相比则无明显差异。结论:1.构建了突变体VP8-CgR4、VP8-CgR5和VP8-ChR8并成功表达了带有His标签的融合蛋白;2.得到免疫佐剂活性增强的突变型VP8-CgR5和VP8-ChR8融合蛋白;3.在突变中,PT8A(Q5)和PT8A(A8)通过鼻腔免疫增强了PT8A的佐剂活性,PT8A的突变S4对PT8A的佐剂活性无影响。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R392

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