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《重庆医科大学》 2019年
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铜绿假单胞菌重组Bb-OprH疫苗的构建及其免疫机制的初步研究

江帆  
【摘要】:目的构建铜绿假单胞菌重组Bb-OprH疫苗,研究疫苗免疫BALB/c鼠及PAO1株攻击后诱导的保护力及其免疫机制。方法将PCR扩增的OprH基因克隆到pGEX-1λT中,得到重组质粒pGEX-OprH;pGEX-OprH经电穿孔转化大肠埃希菌BL21(DE3),SDA-PAGE分析重组菌表达的目的蛋白,Western blot用于鉴定其抗原性。将重组质粒电穿孔至两歧双歧杆菌,SDS-PAGE及Western blot分析并鉴定表达产物。将构建的重组Bb疫苗口服灌胃免疫BALB/c鼠,PAO1株攻击后2周杀死小鼠,计数小鼠肺细菌负荷,ELISA用于测定血清抗体水平,并通过MTT检测脾细胞增殖,流式细胞仪检测脾细胞亚群及脾细胞凋亡,PCR测定脾细胞因子及Treg变化情况。结果通过PCR成功扩增出660 bp的OprH基因,PCR鉴定表明OprH基因成功克隆到pGEX-1λT中。重组质粒成功转化大肠埃希菌BL21(DE3),SDS-PAGE表明重组菌可表达Mr约47 kDa的融合蛋白,Westen blot显示融合蛋白可被Pa感染的鼠血清特异性识别。重组质粒成功转化两歧双歧杆菌,SDS-PAGE显示重组菌可表达Mr约47 kDa的融合蛋白,Westen-blot显示融合蛋白可被Pa感染的鼠血清特异性识别。重组Bb-OprH疫苗免疫及PAO1株攻击后,疫苗组小鼠的肺细菌负荷下降,血清抗体IgG、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平升高,脾细胞增殖增加,以CD4~+T细胞亚群为主,脾细胞凋亡减少,与对照组相比有显著差异。重组疫苗组小鼠脾细胞中抽提的DNA经PCR扩增得到脾细胞IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-17及Foxp3基因片段,而对照组未扩增出相应的基因片段。结论重组Bb-OprH疫苗构建成功,疫苗免疫可诱导小鼠产生保护性的体液及细胞免疫应答,增强小鼠对铜绿假单胞菌感染的抵抗力。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R392-33

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