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脂酰辅酶A结合蛋白(ACBP)及其调控因子SLP2在母胎界面的功能研究

张雪  
【摘要】:目的:哺乳动物的成功妊娠涉及胚胎着床、基质细胞蜕膜化、胎盘形成以及分娩等多个过程。任何一个过程发生异常,均有可能导致妊娠失败。妊娠的成功建立,需要来自母胎界面多种细胞类型之间的相互作用,包括母体子宫的上皮细胞、基质细胞和蜕膜细胞、胎儿的内细胞团以及胎盘滋养细胞等。母胎界面作为生殖学重要的研究热点,已有大量文献探究调控母胎界面的发生机制。在胚胎成功植入后,围植入点的基质细胞发生广泛的增殖与分化,即基质细胞蜕膜化过程。该过程作为妊娠早期母胎界面重要的生理过程之一,可在胎盘形成之前为胚胎的发育提供必要的能量支持以及营养物质供给。在小鼠的早期妊娠过程中,基质细胞蜕膜化发生于妊娠第五天,并形成初级蜕膜区;发展于妊娠第六天,形成次级蜕膜区;于妊娠第八天完成蜕膜化过程,此时胎盘开始逐渐发育。胎盘作为母体与胎儿之间的“桥梁”,对成功的妊娠至关重要。母胎界面另一重要的生理过程—胎盘滋养细胞通过不断地增殖与分化获得高侵袭能力,是母胎界面血管网络形成的基础。脂酰辅酶A结合蛋白(ACBP)在哺乳动物组织的表达高度保守。已有大量研究表明,ACBP参与调控多种细胞类型的增殖、凋亡、脂肪酸代谢以及线粒体功能等过程。但是,目前并无研究表明ACBP是否参与到妊娠早期母胎界面的功能调控。因此,本研究旨在探讨以下问题:1、ACBP是否参与调控母胎界面子宫基质细胞的蜕膜化过程?2、ACBP参与调控基质细胞蜕膜化过程的潜在分子机制是什么?3、ACBP调控因子—线粒体膜蛋白SLP2是否参与调控母胎界面胎盘滋养细胞功能?方法:1.动物模型的建立以及临床标本收集:(1)小鼠早期妊娠模型:8周龄性成熟昆明雌鼠(25-30g)与性成熟昆明雄鼠(25-30g)合笼交配,次日清晨检查阴栓,见阴栓记为妊娠第一天(D1)。颈椎脱臼法处死小鼠,分别收集D1、D4、D5、D6和D8的子宫材料(6只/组)。(2)小鼠假孕模型:性成熟昆明雄鼠(25-30g)结扎输精管休息两周后,与性成熟昆明雌鼠(25-30g)合笼交配。次日清晨检查阴栓,见阴栓记为假孕第一天(PD1)。颈椎脱臼法处死小鼠,分别收集PD1、PD4、PD5、PD6和PD8的子宫材料(6只/组)。(3)小鼠胚胎延迟激活着床模型:8周龄性成熟昆明雌鼠(25-30g)与性成熟昆明雄鼠合笼交配,次日清晨检查阴栓,见阴栓记为D1。于妊娠D3晚,切除孕鼠双侧卵巢。妊娠D4-D6上午,连续三天给予小鼠皮下注射1mg孕激素(P4)(10mg/ml)。妊娠D7天,将小鼠随机分为两组:一组皮下注射1mg P4(10mg/ml),记为延迟着床组(6只/组)。另一组皮下注射1mg P4(10mg/ml)和25ng雌激素(E2)(250ng/ml),记为激活着床组(6只/组)。颈椎脱臼法处死小鼠,收集D8子宫材料。(4)小鼠体内人工诱导蜕膜化模型:性成熟昆明雄鼠(25-30g)结扎输精管休息两周后,与性成熟昆明雌鼠(25-30g)合笼交配。次日清晨检查阴栓,记为PD1。于PD4清晨,一侧的宫角注射10μl玉米油,对侧宫角不注射作为对照。颈椎脱臼法处死小鼠,收集PD8上午收集材料(10只/组)。(5)临床样本:人增生期和分泌期的内膜组织样本取自正常月经周期的健康女性。本研究所有纳入样本均可生育,并且六个月内未使用激素进行治疗;人的早期妊娠蜕膜组织取自6-10周、合法选择性终止妊娠的女性;胎盘绒毛组织取自6-10周、接受合法终止妊娠的正常孕妇以及不明原因流产患者。所有样本均获得知情同意,并根据重庆医科大学附属第一医院伦理委员会要求获得。2.ACBP在子宫内膜标本的表达模式检测:(1)小鼠早期妊娠模型:应用免疫组织化学(IHC)、原位杂交(ISH)、Western blot(WB)和RT-q PCR检测ACBP在小鼠早期妊娠D1、D4、D5IS(Implantation Site,植入点)、D5IIS(Inter-Implantation Site,植入旁)、D6IS、D6IIS和D8子宫内膜组织的表达模式。(2)小鼠假孕模型:采用IHC、WB以及RT-q PCR检测ACBP在PD1、PD4、PD5、PD6和PD8子宫内膜的表达模式。(3)小鼠胚胎延迟激活模型:应用IHC和ISH检测ACBP在延迟着床组与激活着床组子宫组织的表达模式。(4)小鼠体内人工诱导蜕膜化模型:首先,分别通过检测小鼠左右两侧子宫重量、子宫形态以及蜕膜化标志物dtprp的m RNA水平三方面验证模型建立的成功与否;其次,采用IHC、ISH、WB和RT-q PCR分别检测ACBP在体内诱导模型对照组(IDC)以及诱导组(ID)子宫内膜的表达模式。(5)人的子宫内膜以及蜕膜组织化标本:采用IHC检测ACBP在正常人的增生期和分泌期子宫内膜组织以及早期妊娠蜕膜组织的表达模式,并进行统计分析。3.ACBP调控基质细胞蜕膜化的分子机制:(1)子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化模型:分离小鼠的原代子宫内膜基质细胞(m ESCs),使用终浓度分别为10n M雌激素(E2)与1μM孕激素(P4)建立m ESCs体外诱导蜕膜化模型。分别通过检测蜕膜化标志物的表达以及基质细胞形态变化两方面明确模型的建立是否成功。(2)ACBP调控基质细胞的增殖、凋亡和衰老过程:采用WB、Ed U和流式细胞术检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞凋亡的影响;采用β-半乳糖苷酶染色、WB和RT-q PCR检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞衰老的影响。(3)ACBP调控基质细胞的糖、脂代谢过程:应用WB和RT-q PCR检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞脂肪酸转运、合成、氧化和酯化以及葡萄糖代谢基因表达的影响。(4)ACBP调控线粒体功能和细胞自噬:采用DCFH-DA探针检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞活性氧(ROS)产生的影响;采用JC-1探针检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞线粒体膜电位的影响;采用ATP试剂盒检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞内ATP含量的影响;采用WB和RT-q PCR检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞线粒体生物合成基因表达的影响;通过Mito Tracker Red染色试剂盒,检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞线粒体形态的影响;采用WB检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞自噬蛋白表达的影响。4.ACBP调控母胎界面SLP2的表达和功能:(1)ACBP调控妊娠早期母胎界面SLP2的表达:采用WB和RT-q PCR检测沉默acbp基因对子宫内膜基质细胞(m ESCs)和胎盘绒毛细胞系(HTR8/SVneo,HTR8)的slp2基因的m RNA和蛋白水平表达的影响。(2)应用IHC检测ACBP与SLP2二者在人早期妊娠蜕膜组织以及绒毛组织表达的共定位关系。(3)采用免疫荧光(IF)和IHC检测SLP2在人的正常早期妊娠绒毛组织/蜕膜组织的表达;应用IF以及WB检测SLP2在JAR、HTR8和HPT8三种人胎盘滋养细胞系的蛋白表达水平差异。(4)SLP2调控滋养细胞的增殖、迁移和侵袭能力:采用WB和CCK8检测沉默slp2基因对HTR8细胞增殖的影响;应用划痕实验、Transwell、WB以及人绒毛外植体实验检测沉默slp2基因对细胞迁移以及侵袭能力的影响。(5)SLP2调控线粒体功能:采用DCFH-DA探针检测沉默slp2基因对HTR8细胞内活性氧产生的影响;采用JC-1探针检测沉默slp2基因对HTR8细胞线粒体膜电位的影响;采用ATP试剂盒,检测沉默slp2基因对HTR8细胞内ATP含量的影响;采用WB和RT-q PCR检测沉默slp2基因对HTR8细胞线粒体生物合成基因表达的影响。(6)采用IF、WB和RT-q PCR检测SLP2在正常和不明原因流产的绒毛组织的表达模式。结果:1.ACBP的表达与基质细胞蜕膜化的关系:(1)ACBP在小鼠早期妊娠模型子宫中的表达规律:IHC结果表明,ACBP表达于D1子宫内膜的腔上皮和腺上皮细胞,较弱表达于基质细胞;在小鼠着床窗口期(D4),ACBP开始表达于基质细胞;并且,在D5着床点(IS)周围的初级蜕膜区(PDZ)以及在D6和D8的次级蜕膜区(SDZ)的基质细胞中广泛表达;ISH结果与IHC的结果一致。WB结果显示,ACBP蛋白在D4、D5、D6和D8的蛋白表达显着高于D1;在D5和D6,在着床点的表达明显高于着床旁;ACBP蛋白较高表达于D8;RT-q PCR结果与WB结果一致。(2)ACBP在小鼠假孕模型子宫中的表达规律:IHC结果表明,ACBP在PD1和PD4表达于子宫内膜的上皮细胞,较弱表达于基质细胞;在PD6和PD8的表达降低。WB检结果显示,ACBP在PD4和PD5表达较高,在PD6和PD8中的表达较低。RT-q PCR和WB的结果一致。(3)ACBP在小鼠胚胎延迟激活模型子宫中的表达模式:IHC和ISH结果显示ACBP在延迟着床子宫中主要表达于腔上皮细胞和腺上皮细胞,在基质细胞有微弱的表达;在延迟着床激活胚胎着床后,ACBP较强表达于子宫内膜基质细胞。(4)ACBP在小鼠体内人工诱导蜕膜化模型子宫中的表达模式:小鼠子宫形态、两侧子宫重量统计和蜕膜化标志物dtprp m RNA表达水平结果证明小鼠体内模型的成功建立;IHC、ISH、WB和RT-q PCR结果表明,acbp的m RNA和蛋白水平在人工诱导蜕膜化模型的诱导组(ID)子宫高表达。(5)ACBP在人子宫内膜和早期蜕膜组织的表达模式:IHC结果表明,ACBP在增生期子宫内膜较弱表达;在分泌期的子宫内膜表达逐渐增强,开始表达于腔上皮细胞;在早期蜕膜组织中呈现较强表达趋势。2.ACBP调控基质细胞蜕膜化的分子机制:(1)ACBP对CPT1的调控和作用:WB、RT-q PCR以及CCK8结果表明,ACBP调控基质细胞中CPT1的表达;但是,CPT1抑制剂对ACBP的表达无调控作用。(2)沉默acbp基因或抑制CPT1对基质细胞体外诱导蜕膜化的影响:RT-q PCR和WB结果表明,在蜕膜化过程中,沉默acbp基因或抑制CPT1显著降低基质细胞蜕膜化标志物dtprp、prl3c1和hoxa10的表达;并且,影响蜕膜化过程中基质细胞的形态变化。(3)沉默acbp基因或抑制CPT1对基质细胞的增殖、凋亡和衰老的影响:流式细胞术、WB和Ed U结果表明,沉默acbp基因或抑制CPT1,抑制蜕膜化过程中基质细胞的增殖;流式细胞术和CCK8结果表明,沉默acbp基因或抑制CPT1,促进蜕膜化过程中基质细胞的凋亡;WB、β半乳糖苷酶染色以及RT-q PCR结果表明,沉默acbp基因或抑制CPT1,促进蜕膜化过程中基质细胞的衰老过程。(4)沉默acbp基因或抑制CPT1对糖、脂代谢的影响:WB和RT-q PCR结果表明,在体外诱导蜕膜化过程中,沉默acbp基因或抑制CPT1,抑制了脂肪酸的转运和氧化,促进脂肪酸合成过程;但是,对糖代谢过程无调控作用。(5)沉默acbp基因或抑制CPT1对线粒体功能和自噬的影响:DCFH-DA探针、JC-1探针、ATP含量检测试剂盒、WB以及RT-q PCR的结果表明,诱导基质细胞蜕膜化过程中,沉默acbp基因或抑制CPT1促进ROS的产生、降低线粒体膜电位、抑制线粒体生物合成以及诱导细胞自噬的水平的增加;但是,对线粒体的形态并未产生影响。3.ACBP调控母胎界面SLP2的表达和功能:(1)ACBP调控SLP2的表达:WB和RT-q PCR结果表明ACBP调控母胎界面基质细胞和滋养细胞SLP2的表达。(2)ACBP与SLP2蛋白的共定位表达:IHC连续切片检测ACBP与SLP2,发现SLP2与ACBP二者共定位表达于胎盘绒毛的细胞滋养层细胞(CTB)、合体滋养层细胞(STB)以及绒毛外滋养层细胞(EVT)。(3)SLP2在早期妊娠胎盘组织以及滋养细胞系的表达模式:IHC和IF结果表明,SLP2表达于早期妊娠胎盘绒毛的CTB、STB和EVT;IF和WB检测SLP2在胎盘滋养细胞系的表达,结果发现相较于CTB细胞系JAR,SLP2较强表达于EVT细胞系—HTR8和HPT8。(4)SLP2调控HTR-8/SVneo增殖、迁移和侵袭:WB、RT-q PCR和CCK8结果表明,沉默slp2基因抑制细胞的增殖;划痕实验、Transwell、WB、RT-q PCR以及绒毛外植体实验结果表明,沉默slp2基因抑制细胞的迁移和侵袭能力。(5)SLP2调控线粒体功能:DCFH-DA探针、JC-1探针、ATP含量检测试剂盒、WB以及RT-q PCR的结果表明,沉默slp2促进ROS的产生、降低线粒体膜电位、抑制线粒体生物合成;但是,对线粒体的形态不产生影响。(6)SLP2在流产绒毛组织的表达:IF、WB以及RT-q PCR结果显示,相对于正常组,slp2基因的m RNA和蛋白在流产绒毛组织中低表达。结论:1.ACBP在小鼠早期妊娠模型、假孕模型、胚胎延迟激活模型以及人工诱导蜕膜化模型子宫的表达模式,提示ACBP可能参与小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化过程;ACBP在人的子宫内膜标本以及早期妊娠蜕膜组织的表达模式,提示ACBP参与人的子宫基质细胞的蜕膜化过程。2.在基质细胞蜕膜化过程中,ACBP参与调控增殖、凋亡、衰老、脂肪代谢以及线粒体功能;沉默acbp基因或抑制CPT1导致子宫内膜基质细胞的蜕膜化进程受阻。3.ACBP调控母胎界面SLP2的表达,二者共定位表达于母胎界面的多种细胞类型;SLP2在胎盘滋养细胞通过调控线粒体功能进而影响滋养细胞的增殖、迁移和侵袭能力。


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