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《重庆医科大学》 2002年
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EGFR介导的c-erbB2反义显像诊断乳腺癌的实验研究

黄家君  
【摘要】: 目的:探讨受体介导的反义显像作为乳腺癌早期诊断新方法的可行性,使患者能够得到早期诊断、及时治疗,降低乳腺癌的死亡率。 方法:采用自行合成的双功能螯合剂-巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯;用临床最常用的、物理性能优良的~{99m}Tc标记乳腺癌的一个主要癌基因c-erbB2 mRNA的反义寡核苷酸;研究了标记产物的标记率、放射化学纯度、比活度、稳定性、血浆蛋白结合率、生物学分布、药代动力学特点、细胞的摄取率及返流比率、细胞的生长、癌蛋白的表达;对荷乳腺癌裸鼠进行显像。 人工合成的3条15碱基的单链寡核苷酸,反义序列为:5'-NH_2-FTCCATGGTGCTCAC-3',正义序列为:5'-NH_2-QTGAGCACCATGGAG-3',无义序列为5'-NH_2-FGCCTTATCCGTAGC -3'(F,Q分别代表硫代磷酸化的碱基C、G)。反义寡核苷酸与c-erbB2癌基因 mRNA互补,正义、无义寡核苷酸作为对照。用~{99m}Tc标记后,以0.25M/L乙酸铵(pH=5.2)作为洗脱液,将标记混合物通过SephadexG25柱层析进行分离纯化。根据SephadexG25柱层析纯化结果,绘制淋洗曲线,计算标记率,收集第一个放射峰,用纸层析测定标记产物的放射化学纯度;分析标记产物室温放置4h后或与人血清孵育4h后的稳定性,用抽滤法测定标记的EGF-~{99m}Tc-ON的比活度。用50ml培养瓶90个,每个接种2.0×10~5个 WP=7 细胞,移入二氧化碳孵箱培养2天。当细胞覆盖瓶壁50%-60%时,每个培养瓶分别转染2μg EGF-~{99m}Tc-ON或~{99m}Tc-ON,在20min、40min、60min、120min、180min时测定细胞的摄取率,18h后测定细胞的返流比率,并对三组的返流比率进行比较。采用96孔板,每孔接种5.0×103个细胞,培养48h后,分别将含0.5μCi、1.0μCi、2μCi、5μCi等不同浓度的三种EGF-~{99m}Tc-ON及0.2μg、0.4μg、0.8μg、1.6μgEGF-PL复合物转染癌细胞,每种浓度加入3个孔中,24h再加入四唑盐,处理后测定各孔的吸光度。用50ml培养瓶18个,每瓶接种5.0×10~5个癌细胞,培养48h后,每瓶分别转染EGF-~{99m}Tc-ASON或三种~{99m}Tc-ON 2μg,或6μg EGF-PL复合物,24h后,测c-erbB2癌蛋白的表达水平。用三氯乙酸沉淀法测定EGF-~{99m}Tc-ON与家兔血浆蛋白结合率。以家兔为实验对象,研究EGF-~{99m}Tc-ASON和~{99m}Tc-ASON的药代动力学,绘制其药代动力学曲线,用3P97软件拟合药代动力学曲线方程。以雌性BALB/c小鼠为实验对象,每只经尾静脉注入约3μCi的EGF-~{99m}Tc-ASON或~{99m}Tc-ASON后,分别在0.5h、1h、2h、4h、8h、24h测定肝、脾、肾、心、血、肺、胃、肠、骨、脑、肌肉等组织器官的放射性计数,研究EGF-~{99m}Tc-ASON和~{99m}Tc-ASON在正常小鼠体内的分布。SKBR-3乳腺癌细胞1.0×10~7个接种每只裸鼠,让癌细胞在裸鼠体内生长15天,待肿瘤直经约为1cm时,乳腺癌模型构建完毕。将EGF-~{99m}Tc-ASON和~{99m}Tc-ASON 3μCi/鼠经尾静脉注入体内,分别于0.5h、1h、2h、4h测定肝、脾、肾、心、血、肺、胃、肠、骨、脑、肌肉、肿瘤等组织器官的放射性计数,研究EGF-~{99m}Tc-ASON和~{99m}Tc-ASON在荷瘤裸鼠体内的分布。将EGF-~{99m}Tc-SON和 WP=8 EGF-~{99m}Tc-NON以相同的浓度和方式注入裸鼠体内,于2h时测定上述组织器官的放射性计数,并比较三种EGF-~{99m}Tc-ON之间的差异。将EGF-~{99m}Tc-ASON按0.1mCi/鼠经尾静脉注入体内,分别于注射后1h、2h、3h、4h用SPECT进行显像。 结果:寡核苷酸的标记率分别为:反义寡核苷酸70.6%,正义寡核苷酸67.2%,无义寡核苷酸69.3%;分离纯化后放射化学纯度分别是97.8%、96.2%、97.1%;比活度分别为1.41MBq/μg、1.26MBq/μg、1.53MBq/μg;三种寡核苷酸的标记率、放射化学纯度和比活度相比较均无显著性差异(P0.05)。EGF-~{99m}Tc-ON在室温放置4h,或与血清孵育4h后均相当稳定。血浆蛋白结合率分别为:反义寡核苷酸11.82%,正义寡核苷酸12.78%,无义寡核苷酸10.93%,三者之间无显著性差异(P0.05)。细胞摄取率在20min-120min内,随时间的延长而增加,EGF-~{99m}Tc-ON细胞摄取率明显高于~{99m}Tc-ON,有显著性差异(P0.05),在每一时间点前者的摄取率均比后者高3倍以上。细胞返流比率为:反义寡核苷酸21.81%,正义寡核苷酸39.28%,无义寡核苷酸50.76%,反义寡核苷酸明显低于正义和无义寡核苷酸(P0.05),但三者的返流比率都较高。MTT实验,吸光度值:EGF-~{99m}Tc-ASON<~{99m}Tc-ASON<其余各组,用流式细胞仪测定癌蛋白的表达水平,EGF-~{99m}Tc-ASON组荧光强度最低,表明其能有效抑制癌基因的表达,使癌蛋白的表达量下降,与其它各组(~{99m}Tc-ASON、EGF- ~{99m}Tc-SON、EGF-~{99m}Tc-NON、EGF-PL及空白对照组)相比,有显著性差异(P0.05)。EGF-~{99m}Tc-ASON和~{99m}Tc-ASON在体内的药代动力学符合二室模型,其曲线方程为: WP=9 EGF-~{99m}Tc-ASON(KBq):C=47.24351e~{-0.16598t}+1.83133e~{-0.00651t} ~{99m}Tc-ASON(KBq):C=78.43123e~{-0.32872t}+2.068347e~{-0.00728t} 正常BALB/c小鼠体内放射性分布以肝、肾为最高,肺、脾、
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R737.9

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