经母婴传播获得HBV感染儿童及其母亲体内HBV PreS/S准种序列及EnhⅡ/CP/PreC变异特点的研究

【摘要】： 目的 通过对经母婴传播获得HBV感染的子女及其母亲慢性携带者体内HBV PreS/S基因和EnhⅡ/CP/PreC基因的研究，了解来源相同的HBV毒株在不同程度的病毒血症情况下(1)PreS/S基因序列有无准种存在及其特点，(2)EnhⅡ/CP/PreC基因变异的特点以及与HBV复制的关系。为进一步研究各种HBV相关肝病与准种PreS/S基因序列、EnhⅡ/CP/PreC基因变异的关系奠定基础。 方法 1 重庆地区HBV流行株PreS/S、EnhⅡ/CP/PreC基因标准参照序列的建立：以10例3～6岁、未接种过乙肝疫苗、未使用过抗HBV药物的HBV慢性携带儿童为对象，应用ELISA方法检测肝炎病毒A、B、C、D和E的血清学标志物、应用HBV定量PCR法测定血清HBV DNA滴度。酚/氯仿抽提法提取血清中的DNA，PCR扩增PreS/S和EnhⅡ/CP/PreC基因，其产物直接测序。所测的S基因与GenBank中已确定的基因型(A～G)HBV的S基因进行比较，异质性＜4.0％ 重庆医科大学博士学位论文 的为同一基因型。根据S基因编码的I-IBsAg上特定的氨基酸确定 }丑3V的血清型。使用Clustalxl(1．8 I)程序对序列进行排列，每个位 点上占多数的核苷酸为标准序列。 2经母婴传播获得ItBV感染儿童及其母亲体内船V的Pre-S／S基因 序列准种特点研究：选择3对母孕前为船V感染的、未接种过乙 肝疫苗的儿童及其母亲AsC，母子均未使用过抗船V药物。检测 肝炎病毒A~E的血清学标志物、测定血清}玎BV DNA滴度。应用 A．T克隆技术构建重组质粒pGEM—PreS／S、双酶切进行鉴定，每个 病人选6个酶切鉴定正确的克隆测序，以36个序列建立种系进化 树，并以重庆地区PreS／S标准序列为参照对准种特点进行分析。 3经母婴传播获得mV感染儿童及其母亲体内|玎BV的 EnhII／CP／PreC基因变异研究：选择15对母孕前为船V感染的、 未接种过乙肝疫苗的儿童及其母亲AsC，母子均未使用过抗HBV 药物。检测肝炎病毒A~E的血清学标志物并测定血清}玎BV DNA 滴度。PCR扩增S基因以及其产物直接测序，以确定病人感染}丑BV 的亚型。应用A．T克隆技术构建重组质粒pGEM—EnhII／CP／PreC、 双酶切进行鉴定，每个病人选2个酶切鉴定正确的克隆测序，并以 重庆地区EnhII／CP／PreC标准序列为参照对变异特点进行分析。 结果 l 重庆地区船V流行株：PreS／S、EnhII／CP／PreC基因标准参照序列 重庆医科大学博士学位论文 的建立：10例}／BV慢性携带儿童均}／BsAg、I-mehg和抗一}tBc 阳性，均为高病毒血症。经PCR扩增、产物直接测序以及序列分 析显示，7例儿童I-IBV为基因型B／血清型adw2，3例为基因型C／ 血清型adrq+。同亚型PreC、S基因同源性较高(97．4-一100％)，PreS 基因较低(93．9-99．3％)。在HBV基因型和血清型均相同的情况 下建立了重庆地区B／adw2亚型和C／adrq+亚型HBV流行株 PreS／S、EnhlI／CP／PreC基因标准参照序列。与华东华南地区同亚 型的标准参照序列相比较，B／adw2亚型分别有6个、1个核苷酸 差异(同源性分别为99．5％、99．6％)，C／adrq+亚型分别有13个、 2个核苷酸差异(同源性分别为98．9％、99．3％)。而所建立的本地 区的不同亚型标准参照序列分别有95个、9个核苷酸差异(同源 性分别为92．1％、96．8％)。 ． 2经母婴传播获得HBV感染儿童及其母亲体内I-IBV的Pre-S／S基因 序列准种特点研究；．选择3对AsC母子， 第1对子女母亲均为高 ● l_ 病毒血症，第1I对子女为高病毒血症而母亲为低病毒血症，第ⅡI对 子女为低病毒血症而母亲为高病毒血症。高病毒血症病人均为 }／BeAg(+)，低病毒血症均为抗一}／Be(+)。3对母子}玎BV亚型相同， 为B~dw2。 2．1 种系进化树的建立： 36个克隆序列建立的种系进化树显示三例 儿童的PreS／S基因均与其母亲的基因为同一株}丑Bv的PreS／S进 化而来。每例病人的6个序列不尽相同，但均有各自的进化范围， 有各自的优势株。低病毒血症病人的}玎BV PreS／S(无论母亲还是 儿童体内)的进化距离均较高病毒血症病人远、且同一病人的不 同克隆间差异较明显。 2．2变异方式的分析：替代是变异最主要的方式，无插入变异存在。 低病毒血症髓V PreS／S的核苷酸变异率(8．04～8．19％)明显高 于高病毒血症(1．12～1．41％)，而与年龄无明显关系。 2．3 变异位点及变异热点的分析：高病毒血症的24个克隆中共有40 个变异位点，无明显变异热点。在低病毒血症病人II．M的105 个变异位点与ⅡI．C的103个变异位点中，两个病人共有的、每个 病人4／6个以上克隆存在的变异位点(即变异热点)有94个，可 引起37个氨基酸变异，绝大多数位于目前确定的T．淋巴细胞表 位和B一淋巴细胞表位内或／和附近。 3 经母婴传播获得}玎BV感染儿童及其母亲体内|玎BV的 。EnhlII／CP／PreC基因变异研究：选择15对AsC儿童及其母亲，根据 皿V病毒血症的高低分为3组，每组5对母子，即I组、II组和 III组(与第二部分同)，高病毒血症病人均为}]J