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《重庆医科大学》 2003年
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嗜麦芽窄食单胞菌金属β-内酰胺酶的系列研究

卓超  
【摘要】: 目的:筛选我院监护病房分离的产金属β-内酰胺酶(MBL)嗜麦芽窄食单胞菌株,调查产酶株对抗菌药物的耐药性,了解其分子流行病学特征;检测MBL的等电点及酶对抗生素的稳定性;检测MBL的编码基因,进行序列分析,明确酶基因表型;构建含嗜麦芽窄食单胞菌MBL编码基因的重组体,并在E. coli BL21中表达,从基因和蛋白水平明确MBL在细菌耐药机制中所起的作用。 方法:收集1998年1月-2001年12月重庆医科大学附属第一医院监护病房临床分离得到的422株革兰阴性杆菌。用E试验法测定10种抗菌药物对细菌的抗菌活性,筛选耐亚胺培南的产MBL可疑菌株;以Na2EDTA和2-巯基丙酸(2-MPA)为酶抑制剂的纸片协同法,并结合MBL-E试验法进行产MBL菌株确证;肠杆菌科基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)方法确定产MBL菌株的基因型,了解菌株来源、药敏谱和基因型与之间的关系;分光光度法测定MBL阳性菌株所产β-内酰胺酶的对亚胺培南的稳定性;测定金属β-内酰胺酶的等电点(pI);并检测金属β-内酰胺酶对多种抗生素及酶抑制剂的酶稳定性及抑酶效应;挑选其中3株不同基因型、高产亚胺培南水解酶的菌株,设计能扩增编码嗜麦芽窄食单胞菌MBL全基因的通用引物,以染色体DNA为模版进行PCR扩增,产物克隆、测序。以表达质粒pET32a(+)为载体,构建含目的基因片段的重组体,转化大肠杆菌 WP=10 BL21(DE3)并表达,比较表达体与原菌株对亚胺培南和头孢他啶的敏感性。 结果: 亚胺培南对所有菌株的耐药率最低,为11.6%;耐亚胺培南菌株主要分布于嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌,耐药率分别为83.3%(25/30)和16.9%(11/65)。以Na2EDTA和2-MPA为酶抑制剂,用纸片协同法从49株亚胺培南耐药株中分别检测到MBL阳性株4株和7株,均为嗜麦芽窄食单胞菌;MBL-E试验法共检测出MBL阳性株12株,11株为嗜麦芽窄食单胞菌,1株为铜绿假单胞菌。ERIC-PCR结果显示,13株产MBL嗜麦芽窄食单胞菌(含2株阳性对照株)具有10种基因型,其中4株MBL阳性株为同一基因型,其余9株为独立的基因型。13株MBL阳性株对亚胺培南、庆大霉素、阿米卡星、头孢噻肟和头孢曲松完全耐药,对哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟及环丙沙星等6种抗菌药物呈现8种耐药模式,菌株来源、药敏谱和基因型与之间无显著相关性。挑选3株不同基因型、高产亚胺培南水解酶的菌株,测定其酶等电点,2株菌(710、750)所产酶的pI为6.6,1株菌(603)的PI为6.2和8.4;EDTA抑制试验证实pI 6.6和PI 6.2均为金属β-内酰胺酶。酶稳定性试验表明,以对亚胺培南的水解率为100%为基准,嗜麦芽窄食单胞菌所产金属β-内酰胺酶对青霉素的相对水解率最高,达到1400%,其次是氨苄西林、苯唑西林、头孢唑林,相对水解率分别 WP=11 为680%、420%和190%,对拉氧头孢、头孢他啶、氨曲南的相对水解率较低,分别为27%、9%、1%。三种常用β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦都不能抑制金属β-内酰胺酶。PCR结果显示,750和710菌携带金属β-内酰胺酶编码基因(blaMBL),长度均为867bp。经GeneBank网上同源性比较,发现与金属酶L1的编码基因blaS(注册号AJ291672.1)和blaL1(AF010282.1)的核苷酸序列同源性均为99.31%。含目的基因的pET32a(+)重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG 诱导后, SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白为48KDa,其中pET32a(+)表达的蛋白约为22kDa,酶蛋白约为26 kDa,与金属酶L1的分子量(24~26 kDa)相符。药敏结果显示,表达体与原菌株对亚胺培南(IP)的MIC分别为12mg/L和128mg/L,对头孢他啶(TZ)的MIC均为2mg/L;用MBL- E试条检测,表达体为MBL阳性。 结论:我院监护病房分离的革兰阴性杆菌产MBL株主要集中于嗜麦芽窄食单胞菌,菌株来源呈高度的异源性;菌株710和750所产MBL与文献报道的L1型金属β-内酰胺酶的酶学特性和基因表型相似,而菌株603所产金属β-内酰胺酶为非L1型酶,其分子生物学特性有待明确。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R446.5

【参考文献】
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