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《重庆医科大学》 2004年
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三氧化二砷(As_2O_3)对人肾癌786-0细胞系的抑制作用及其机制的研究

王德林  
【摘要】: 目 的 肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,手术仍是治疗原发性肾癌唯一有效的方法。近年来,某些实体肿瘤的化学药物治疗已经取得长足进步,但现有的化学药物和放射治疗对肾癌疗效不明显,大宗病例统计化学药物治疗肾癌的总反应率仅6%。故应进一步探索有效的肾癌治疗方案。20世纪90年代,我国学者成功应用三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)治疗复发性急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL),引起了国内外医学界的极大兴趣。对于As2O3的抗癌作用的研究,已经从血液系统肿瘤进入实体肿瘤。但关于As2O3对肾细胞癌的药理作用和抗肿瘤机制的研究罕见报道。本课题选择人肾癌786-0细胞系为实验对象,研究As2O3对786-0细胞的抑制作用及其分子机制,为临床应用As2O3治疗肾癌提供理论依据。 方 法 与 结 果 第一部分 采用细胞培养、光学显微镜、电子显微镜、MTT和肿瘤细胞克隆形成等方法观察As2O3处理前后786-0细胞生长和细胞形态学的改变、用免疫细胞化学方法检测As2O3处理前后786-0细胞PCNA和ki67蛋白表达的变化。2.0μmol/L以上浓度As2O3可显著抑制786-0细胞的增殖、降低细胞核分裂指数(P 0.01),使786-0细胞内PCNA和ki-67蛋白表达降低(P0.05),肿瘤细胞克隆形成明显减少,其作用随药物浓度升高和时间延长而增加。 第二部分 采用细胞培养、FCM观察As2O3作用786-0细胞后细胞周期的改变,用免疫组化检测As2O3致细胞Cyclin蛋白和CDKI基因的改变,RT-PCR检测Egr-1的改变。以2.0μmol/L或5.0μmol/LAs2O3作用786-0细胞 WP=9 24h、48h、72h,使其细胞周期停滞于G2/M和G0/G1期,周期素蛋白CyclinA、B1、D1、E表达均不同程度降低(P0.05),而其CDKI基因p16、p21WAF!、p27CIPI表达升高(P0.05),Egr-1在2.0μmol/L As2O3处理786-0细胞0.5 h后,开始表达,并随时间延长而增加,4 h达高峰后下降,24 h后消失。 第三部分 采用细胞培养、形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞技术(FCM)和TUNEL技术等方法观察As2O3诱导786-0细胞凋亡,用免疫细胞化学和RT-PCR技术等检测凋亡相关基因p53、bcl-2、c-myc及c-fos的mRNA和蛋白表达的改变。2.0μmol/L以上浓度As2O3作用786-0细胞24h后开始发生细胞凋亡,出现凋亡的形态学改变、DNA片段化和特征性亚二倍体峰(凋亡峰),使786-0细胞内p53活性升高(P0.05),而bcl-2、c-myc和c-fos基因表达降低(P0.05)。 第四部分 采用免疫细胞化学方法检测As2O3处理前后786-0细胞VEGF、nm-23、MMP-9、TIMP-1蛋白表达的改变;RT-PCR分析TGF-β1、TβR-I和TβR-II mRNA表达的改变。2.0μmol/L As2O3处理肾癌786-0细胞系72h后可显著抑制786-0细胞中VEGF、MMP-9的蛋白表达(P 0.01),而促进786-0细胞中TIMP-1和nm-23蛋白的表达(P0.05)。786-0细胞中缺乏TβR-II mRNA,As2O3处理后,786-0细胞中TGF-β1和TβR-I mRNA表达无改变(P0.05)。 第五部分 采用免疫细胞化学、ISH、Western blot和EMSA等技术检测肾癌组织和As2O3作用786-0细胞前后的p65 mRNA含量、NF-κB DNA结合活性及p65、IKKα/β、IκBα和ICAM-1蛋白的表达。结果肾癌组织中NF-κB DNA结合活性及p65、IKKα/β和ICAM-1蛋白表达量升高(P 0.01),但IκBα蛋白明显降低(P 0.01);经2.0μmol/L浓度As2O3处理 786-0细胞72 h后,p65 mRNA含量、NF-κB DNA结合活性及p65、IKKα/β、IκBα和ICAM-1蛋白的表达量均降低(P 0.01)。 结 论 1. As2O3通过降低786-0细胞内PCNA和ki-67蛋白的表达,肿瘤细胞克隆形成明显减少,对786-0细胞具有显著的增殖抑制作用,并具有浓度和时间依赖 WP=10 性特点; 2. As2O3通过降低CyclinA、B1、D1、E蛋白的表达和增强p16、P21WAF!、p27CIPI活性,将786-0细胞阻滞于G2/M和G0/G1期; 3. As2O3可能通过增加p53基因的表达和下调其bcl-2、c-myc和c-fos基因表达诱导人肾癌786-0细胞凋亡; 4. As2O3通过抑制VEGF和MMP-9的蛋白表达,增加TIMP-1和 nm-23蛋白的表达,抑制786-0细胞的血管生成和转移; 5. NF-κB DNA结合活性及p65、IKKα/β和ICAM-1蛋白增加可能与肾癌的发生和进展有关,2.0μmol/L以上浓度As2O3可以全面抑制786-0细胞中p65、IKKα/β、IκBα和ICAM-1蛋白和p65 mRNA的表达,抑制NF-κB DNA结合活性,可能是As2O3抑制786-0细胞增殖并诱导细胞凋亡的另一种机制。 总之,As2O3通过抑制786-0细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制血管生成和NF-κB信号传递通路的激活等多种途径,发挥对肾癌786-0细胞的抑制作用,NF-κB可能成为抗肾癌治疗的新靶点。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R737.11

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