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《重庆医科大学》 2004年
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人参总皂甙对CD34~+造血干/祖细胞体外扩增和分化的作用及机制研究

王建伟  
【摘要】: 造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)工程是利用造血干/祖细胞(HSC/HPC)的高度增殖能力和多向分化潜能的生物学特性,通过细胞工程的技术,在体外模拟和部分模拟体内的造血过程(包括基质细胞的支持和造血生长因子的调控等),对分离纯化的HSC/HPC进行体外扩增、定向诱导分化、功能激活与调控、目的基因转染等,从而在短时间内大量扩增早期造血祖细胞及各阶段的前体细胞,以及定向诱导扩增大量的红细胞、粒/巨噬细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞(Dendritic Cells,DC)、NK细胞、T/B淋巴细胞等功能细胞和免疫活性细胞,并可对部分细胞的功能进行激活和调控,对缺陷性基因进行靶向性转染,最终将造血细胞治疗更广泛和有效地应用于干细胞移植、生物免疫治疗、造血支持治疗和基因治疗等领域。 造血干细胞工程是目前国内外生命科学研究的热点和前沿课题,其研究现状展示了它对临床医学研究领域具有重要的理论价值和应用潜力,同时也为中医药现代化研究带来了新的切入点。中药有效成分对造血干细胞生物学影响的研究结果证实:许多中草药可以作用于不同周期的造血干细胞,并从蛋白质和分子水平影响造血干细胞的增殖与分化,从而达到重建恢复骨髓造血机能的目的,提示开展中药及有效成分对干细胞影响及机制的研究,有助于提高中药研究的科技含量,有效发挥中药的优势,建立疑难疾病治疗的新技术。 人参是祖国传统医学的“补气”要药,人参皂甙是人参中主要的有效药物成 基金项目:本课题为国家自然科学基金资助项目(No.38670880);重庆市科委重点攻关课题(渝科委计[2000]25) WP=9 分。我室着力于人参总皂甙(total saponins of panax ginseng,TSPG)对血发生的影响及机制研究已有二十余年,研究表明:TSPG是人参促进血细胞生成的有效成分。TSPG在体内外均能刺激造血干细胞(CFU-S)和造血祖细胞(CFU-GEMM、CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-MK)的增殖分化。为了进一步研究TSPG在分离纯化的造血干/祖细胞体外操作过程中的作用,挖掘TSPG应用于造血干细胞工程中的潜在价值,我们进行了以下研究:1、建立了人骨髓、脐血CD34+HSC/HPC体外分离纯化技术;2、以CD34+HSC/HPC为模型,研究TSPG协同造血生长因子诱导造血干/祖细胞体外扩增和定向分化的作用;3、采用低温生物学技术,探讨TSPG降低冷冻损伤、提高冷冻复苏后造血细胞的增殖能力;4、应用研究造血生长因子信号转导途径的方法,选择EpoR介导的JAK2/STAT5 信号传导途径,分析TSPG定向诱导红系血细胞发生的分子机制;5、以转染GM-CSF基因的人胚真皮成纤维细胞为滋养层,支持脐血CD34+HSC/HPC增殖和分化,以期在造血干细胞移植的基因治疗方面作出一些有益探索。现将各部分简介如下: 1、人骨髓、脐血CD34+造血干/祖细胞的分离、纯化及鉴定:采用阴性分选策略,以StemsepTM系统建立CD34+HSC/HPC的免疫磁珠无菌分选术,对人骨髓、脐血单个核细胞中的CD34+HSC/HPC进行分选、纯化及免疫细胞化学与流式细胞术鉴定。结果显示:骨髓、脐血单个核细胞(MNC)的CD34+HSC/HPC为0.5%~3.5%,经分选后纯度高达92.8~98%, 分选的细胞台盼蓝拒染率为99%~100%,分选细胞的造血细胞集落产率为MNC的19倍。表明免疫磁珠阴性分选法可有效地分选CD34+HSC/HPC,并保持细胞活性良好,为深入研究HSC/HPC的生物学特征与功能奠定了基础。 2、人参总皂甙对CD34+造血干/祖细胞扩增与分化的作用:通过甲基纤维素半固体培养法检测TSPG协同造血生长因子诱导CD34+HSC/HPC形成CFU-GEMM、BFU-E、CFU-E、CFU-GM的能力;经不同剂量TSPG加入造血细胞因子不同组合培养体系通过液体培养,检测细胞总数,CD34+细胞、CD71+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞总数(CFCs)、红系祖细胞和粒系祖细胞数量变化。结果显示:一定剂量的TSPG能够协同造血细胞因子提高CD34+细胞形成各种造血祖细胞集落产率;能够提高细胞总数,CD34+细胞、CD71+细胞和CD33+细胞比例以及各种造血祖细胞的数量。提示合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与 WP=10 定向诱导分化。 3、人参总皂甙对骨髓造血细胞冷冻损伤的可恢复性研究:以5%二甲基亚砜(DMSO)为冷冻保护剂,采用逐步降温法将骨髓造血细胞在液氮中保存3~5 个月,复苏后应用台盼蓝拒染率、集落形成试验、CD34+及细胞总数回收率等,测定骨髓造血细胞生物学活性的变化;将不同剂量的TSPG与复苏的骨髓造血细胞共培养,应用集落形成试验、MTT 比色分析法及流式细胞术等方法检测TSPG对骨髓造血细胞冷冻损伤可恢复性的影响。结果显示:细胞复苏后,加入合适剂量的TSPG(25μg/ml),可明显提高冻存骨髓造血细胞的集落产率;TSPG在一定浓度内(25~50μg/ml)能促进冻存骨髓造血细胞的增殖;TSPG(25μg/ml)能促进冻存骨髓造血细胞进入细胞增殖周期。研究表明,人参总皂甙能促进冷冻骨髓细胞的复苏、增殖,提高骨髓细胞冷冻损伤的可恢复性,对应用冻存骨髓细胞作造血移植有一定意义。 4、人参总皂甙诱导红系血细胞增殖的信号传递研究:采用半固体集落培养的方法检测TSPG对脐血BFU-E、CFU-E增殖的影响,通过细胞增?
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R285

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【引证文献】
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