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《重庆医科大学》 2004年
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人可溶性gp190 cDNA克隆、酵母表达系统的构建与生物学活性研究

黎刚  
【摘要】: 白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)是一种多功能的细胞因子,在不同的细胞和组织中具有多种生物学活性,近年来发现它在生殖中发挥着重要的作用。LIF启动靶细胞发挥其生物学功能是通过其受体系统实现的。LIF首先与膜受体gp190连接, 而后再同gp130(IL-6信号转导子)连接构成异源性二聚体,启动下游信号传导发挥其生物学效应。1998年发现人体液中存在LIF可溶性受体, soluble gp190(sgp190),但目前对sgp190具体的生物活性的研究尚未见报道。由于LIF在诸多生命活动中的重要作用,研究sgp190的生物活性具有非常重要的意义。 本研究对sgp190在酵母Pichia pastoris中实现了重组sgp190分泌表达。利用基因重组技术,将编码人可溶性gp190(LIF受体α亚基gp190胞外区)cDNA克隆到毕赤酵母Pichia pastoris分泌表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-sgp190。原生质体法转染Pichia pastoris GS115菌株,经过G418筛选,得到了高效分泌表达sgp190蛋白的毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-sgp190,sgp190蛋白占摇瓶培养表达上清中总蛋白质的27%。经初步纯化,对表达产物的性质鉴定表明,其分子量约125 kD,具有免疫活性。获得的sgp190蛋白为体内外深入研究其生物学活性奠定了基础。 WP=10 本研究第二部分以体外培养滋养层细胞为载体,从sgp190对滋养层细胞增殖、分化,激素分泌,IL-10表达,与侵袭力有关的MMP-9和TIMP-1分泌水平及对Jak1-STAT3信号通路中STAT-3磷酸化水平的影响等几个方面对sgp190活性进行了研究。结果显示,30 ng/ml sgp190基本能完全抑制10 ng/ml LIF对滋养层细胞诱导分化作用。LIF能够促进细胞滋养层细胞向合体滋养层细胞分化(P 0.05),而同时施加sgp190与LIF组对细胞分化基本无影响(P 0.05)。细胞增殖(MTT实验)表明,sgp190与LIF不影响滋养层细胞的增殖(P 0.05)。在滋养层细胞体外培养48h前,LIF促进HCG的分泌,而此后,LIF抑制HCG的分泌,sgp190则能抑制LIF的促进或抑制作用。滋养层细胞的侵袭能力与MMPs-TIMPs系统的活性有关,我们通过分析LIF与sgp190对MMP-9 和TIMP-1 蛋白表达水平的影响来研究LIF及其可溶性受体sgp190在MMPs-TIMPs系统中扮演的角色。结果显示,LIF抑制MMP-9 与TIMP-1 蛋白表达(P 0.05),而sgp190促进MMP-9的表达(P 0.05),但对TIMP-1 蛋白表达无影响,sgp190可抑制LIF的作用。 细胞滋养层分泌的Th1/Th2 细胞因子对妊娠的维持起着重要的作用,对妊娠中期滋养层细胞施加LIF和/或sgp190刺激,用ELISA法检测Th2 型细胞因子IL-10 蛋白,结果显示,LIF刺激IL-10 蛋白表达,sgp190无此效应,但sgp190可阻断LIF的作用。 对sgp190作用于LIF的机制研究表明,LIF刺激gp130与gp190 mRNA与蛋白表达,sgp190对gp130与gp190 mRNA与蛋白表达无影响,而sgp190+LIF处理组与空白对照组无差异,说明sgp190可能通过结合 WP=11 LIF,使LIF游离浓度减少,对细胞的刺激降低,从而导致LIF的膜受体gp130与gp190表达减弱,以此抑制LIF的作用。 LIF传导信号的主要通路是通过STAT3磷酸化作用。在信号通路方面,LIF与JAK-STAT(signal transducer and activator of transcripition, STAT)途径的关系明确,LIF作用于受体之后可以激活JAK1-STAT3途径。结果提示LIF使STAT-3磷酸化水平升高,sgp190能够抑制LIF刺激磷酸化水平升高的作用。此外,sgp190也能单独抑制STAT-3磷酸化。 LIF在胚泡着床窗口期出现爆发性表达,其在胚泡植入中的重要性已得到公认。由于sgp190可能对人体整个循环中LIF表达具有调节作用,因此,在第三部分我们对正常能育妇女和原因不明不孕患者植入窗口期(D19-21)血浆中sgp190与LIF进行测定,以探索sgp190在胚泡植入中可能起的生物学作用。结果显示原因不明不孕患者在植入窗口期(D19-21)LIF表达较正常能育者低(P0.01),而sgp190表达略高,进一步说明sgp190在LIF发挥效应中具有调节作用。 第二、三部分研究结果表明:sgp190对局部或整体LIF的活性起负性调节作用,可能是LIF生物活性的一个调节子。通过抑制LIF活性而在滋养层细胞的增殖、分化、侵袭特性等方面具有调节作用,与胚泡植入、妊娠建立与维持相关。其作用机制可能是通过与LIF结合,使局部或整体的LIF有效浓度下降,通过反馈机制,LIF的膜受体gp130与gp190表达减少,下游信号通路活动减弱,从而使LIF的效应受到抑制。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R346

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【共引文献】
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