天然药物氧化苦参碱、绿茶多酚对鼻咽癌HNE-1细胞耐药逆转研究

【摘要】： 恶性肿瘤已成为威胁人类健康及生命的严重疾病，目前化学治疗是恶性肿瘤治疗的重要手段之一，但其效果并不理想。肿瘤对化疗药物的抗药性是主要障碍，而未能针对不同的肿瘤类型、不同的肿瘤患者个体选择敏感的药物也是重要原因。鼻咽癌是头颈部常见恶性肿瘤，临床上以放疗和化疗为主要治疗手段。本研究以鼻咽癌HNE-1细胞株为研究对象，采用高能放射线照射HNE-1细胞，获得耐药细胞HNE-1(200)；用MTT法，检测4种临床常用抗肿瘤药物(长春新碱、平阳霉素、顺铂、5-Fu)、氧化苦参碱、表儿茶素、儿茶素及维拉帕米对两种细胞增殖抑制作用，初步得知药物对两种细胞的耐药谱及低毒浓度信息，结果发现： 1、每种药物对两种细胞有不同程度的抑制作用： 1) 长春新碱对细胞抑制率为20％以下的浓度是25ug/ml、50ug/ml；在75ug/ml、100ug/ml和125ug/ml浓度条件下，长春新碱对HNE-1(200)细胞的抑制率较HNE-1细胞明显下降，说明与HNE-1细胞经X—线照射有关，提示放射线照射可使细胞对化疗敏感性降低，诱导细胞产生耐药。 重庆医科大学博d匕学位论文 2)平阳霉素对细胞抑制率为20%以下的浓度是20u留ml、40u留ml;在 相同浓度条件下，平阳霉素对HNE一1(200)细胞的抑制率较HNE一1 细胞明显下降，说明放射后的HNE一1(200)细胞对平阳霉素有耐药 性。 3)5一Fu对HNE一1、HNE一l(200)细胞的抑制率呈明显的浓度依赖关系， 相同浓度5一Fu对两种细胞的抑制率无明显差异。 4)顺铂对HNE一1、HNE一l(2oo)细胞的抑制率没有差异，抑制率与药物 浓度成正相关。 5)维拉帕米对HNE一1、HNE一1(2oo)细胞有抑制作用，但对两种细胞的 抑制作用没有差异。 6)氧化苦参碱HNE一1、HNE一1(200)细胞有抑制作用，但对两种细胞的 抑制作用没有差异。 7)儿茶素、表儿茶素对HNE一1、HNE一l(200)细胞几乎没有抑制作用。 2、为了进一步得知HEN一1(2oo)细胞的耐药逆转药谱及逆转浓度，采用 对HNE一1(200)和HNE一1细胞株无明显抑制作用剂量的维拉帕米、氧化 苦参碱、儿茶素、表儿茶素分别与抗肿瘤药物联合作用于细胞，结果 发现: 1)低毒浓度药物间联合作用均明显增加了抗肿瘤药物对HNE一1、 HNE一1(200)细胞增殖的抑制作用，提示临床采用联合用药有可 能达到既治疗肿瘤，又减少药物的用量、减少毒副作用的目的。 2)维拉帕米、氧化苦参碱、儿茶素和表儿茶素分别与抗肿瘤药物联合 重庆医科大学博士学位论文 作用后，其药物增敏作用强度由高到低依次为维拉帕米、氧化苦参 碱、儿茶素和表儿茶素。 3)维拉帕米、氧化苦参碱、儿茶素和表儿茶素分别与抗肿瘤药物联合 作用后，可逆转HNE一1侈oo)细胞对长春新碱和平阳霉素的耐药性。 4)维拉帕米分别与长春新碱、平阳霉素联合使用对HNE一1(200)细胞的 抑制作用明显强于对HNE一1细胞的抑制作用，氧化苦参碱的药物增 敏强度与维拉帕米相似。 为了更进一步了解鼻咽癌放疗后产生多药耐药的本质，本研究采 用免疫组织化学及Westem blot检测了不同条件下细胞株P一糖蛋白表达; 用FCM分析细胞周期的变化，以期对其耐药机制作进一步深入了解。 结果如下: 1、免疫组织化学提示: 1) HNE一1细胞P一gP表达为阴性，HNE一1(200)细胞P一gP表达为阳性， 说明放射线照射能诱导HNE一1细胞P一gp表达增加，从而导致 HNE一1(200)细胞对vCR和BLM产生耐药。 2)维拉帕米、氧化苦参碱、表儿茶素和儿茶素与HNE一1仅oo)细胞共孵 育24小时，P一gp表达下调，维拉帕米作用最强，其它次之。 2、Westem Blot检测结果显示: 1) HNE一1细胞P一gP无表达，HNE一l(200)细胞P一gP表达量最高，与免 疫组化检测结果和细胞的耐药性增加相符合。 2)维拉帕米、氧化苦参碱、表儿茶素和儿茶素与HNE一l(2oo)细胞共孵 重庆医科大学博士学位论文 育24小时，P一gp表达下调，与它们能逆转VCR的耐药相一致。维 拉帕米对P一即表达下调作用最明显，其次是表儿茶素、儿茶素和氧 化苦参碱。 3、RT一PCR结果显示: 1) HNE一1、HNE一l(200)细胞的MDRmRNA表达无差异，即HNE一1细 胞经x一射线照射后，P一gP表达上调，但是MDR mRNA表达并无 增加，说明P一gp表达上调受多种机制调控。 2)电泳图显示:除维拉帕米有下调MDR mRNA作用外，其余的都无 变化。 4、通过对细胞周期的分析发现: 1) HNE一1细胞经X一线小剂量多次照射后，G:期细胞阻滞增加2.5倍， 与文献报道相一致; 2) vcR+vRp和vCR+oxy能除去G:期细胞阻滞，抑制细胞增殖。 vRP通过下调P一gP表达来增加肿瘤药物的药效，oxy也有相同作 用，推测低毒浓度下的药物联合作用提高药效与P一gP表达下调有 关; 3) vCR+EC和VCR+儿茶素除去细胞Gl期阻滞，同时q期阻滞上 升，儿茶素有下调P一gP的作用，诱导细胞发生q期阻滞与文献一 致，而与对照药物维拉帕米及其氧化苦参碱不同，发生机制有待进 一步研究; 4)BLM与几种药物的联合作用结果同VCR的药物联合作用结果相 重庆医科大学博.士