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《重庆医科大学》 2004年
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土贝母活性成分分离、结构鉴定及抗肿瘤机理研究

于超  
【摘要】: 土贝母Bolbostemma paniculatum (Maxim.) Franquet 也称土贝、大贝母、地苦胆、草贝、假贝母、野瓜蒌等,为葫芦科植物,是一种传统中药。主产于河南、陕西、山东等地。药用其干燥鳞茎,清代赵学敏编著的《本草纲目拾遗》载:味大苦,专消痈疽毒痰,杨梅结核,非此不除。古代用它来治疗乳岩、乳痈、乳腺增生和瘰疬等疾患,具有散结毒、消痈肿的功效。四川省和陕西省的老中医用它来治疗食管癌和胃癌。民间常用来治疗皮肤上各种疣病,显示其抗病毒的效果。由于其具有抗肿瘤、抗病毒和杀精子等药理作用,因此引起广泛的关注。自80年代起,对其化学成分开展研究,得到的活性成分为一些五环三萜皂苷,属于齐墩果酸型皂苷。其中土贝母皂苷甲、乙均具有抗肿瘤作用,这些研究成果为进一步深入研究打下了较好的理论基础。 20世纪70年代以后,癌症的发病人数以每年3%—5%的速度递增。癌症严重危害人类健康,己成为仅次于心血管病的人类第二杀手。癌症的发生与环境的改变有着密切的关系,其给人类造成的危害主要是细胞恶性增殖造成机体重要生命活动器官的毁损和肿瘤的广泛扩散转移而导致病人死亡。从天然动、植物中寻找低毒、高效的抗癌活性成分是近年来国内外癌症防治研究的热点之一。美国、欧洲、日本及我国相继开展了从天然可食植物或中药中筛检抗癌物的研究。通过筛检体系的广泛筛选,对部分具有高效抗诱变作用的物质进行了体内外抗癌实验研究,并用于临床,例如从红豆杉植物中分离出抗癌活性成分紫杉醇。从中药中寻找能够说明作用机理的单体活性成分,也是 WP=9 当今很活跃的研究领域,并取得一定的成绩。例如从喜树果实中分离出的抗癌活性成分喜树碱和10-羟基喜树碱等衍生物;从中药斑蝥中分离出抗肝癌活性成分斑蝥素等。这些成功的例子都为我们寻找更多用于治疗癌症的新化合物展示了广阔的美好前景。 本研究在前人研究的基础上,以小鼠肺癌(LLC)细胞毒体外模型为生物活性指导,通过系统分离筛选组分法对土贝母化学成分进行分离,应用质谱技术、二维核磁共振技术等对其结构进行鉴定,最终分离出具有活性的成分—土贝母皂苷甲、乙和丙。特别对前人研究较少的土贝母皂苷丙,运用二维核磁共振技术首次进行了质子的全归属研究,确定了结构。并对其抗肿瘤作用及作用机理首次进行了研究,为进一步新药研究与开发奠定了理论基础。全文分四个部分: 土贝母有效成分生物活性指导下的分离纯化 土贝母干燥鳞茎粉碎后甲醇提取,提取物水溶解后分别用正己烷、氯仿萃取得到不同部位,经LLC体外细胞毒活性检测,对活性最高的水层部分继续使用大孔树脂层析,经反复硅胶层析分离,部分流份经HPLC纯化,最终得到8个化合物。 结构解析 采用紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁共振技术鉴定出其中3个化合物,特别对土贝母皂苷甲、丙首次通过各种二维核磁共振技术,如HMBC、HMQC、COSY、TOCSY等,对C、H信号进行了归属。通过1H-1H COSY谱分析,把分子中偶合氢的化学位移关联起来,指明1H-1H连接问题,就是说明分子中同碳氢、邻位氢和W型氢偶合关系及其相关的结构单元。对于糖苷中的糖分子结构,可以从各糖的端基质子开始分析1H-1H相关信号峰,通过H-1/H-2,H-2/H-3,H-3/H-4……推导,可以在1H-1H COSY谱上清楚地看到以上各相关信号,准确归属相应糖的H-1~H-5连接顺序。与过去在糖残基分析上仅仅通过整个糖的一组信号与甲基化或酰基化糖的一组信号对比而推导结果相比,其可靠 WP=10 性、准确性得到保证,改变了过去对个别质子信号只能靠猜测的做法。对土贝母皂苷分子中的C、H信号通过2D NMR进行归属的研究还未见报道。我们此次研究填补了这个空白。 土贝母皂苷丙抗肿瘤实验 土贝母总皂苷或皂苷甲、乙抗肿瘤研究报道较多,但土贝母皂苷丙的药理作用未见报道,本研究针对土贝母皂苷丙的抗肿瘤活性用MTT法进行广谱检测,并使用流式细胞仪对其中肠癌SW480细胞周期的影响进行检测,取得较好的结果,土贝母皂苷丙对所选的8种肿瘤细胞有较强的增殖抑制作用,且活性普遍比皂苷甲强,其50%抑制效应IC50均低于皂苷甲的IC50。 SW480细胞周期分析表明,皂苷丙对其细胞周期的影响主要使细胞阻滞在G1期,当其作用72h以上,用流式细胞仪可以看见细胞凋亡峰。对不同的肿瘤细胞检测发现,共同之处是土贝母皂苷均可使肿瘤细胞阻滞在细胞间期,但能否引起细胞凋亡,对不同细胞有不同的结果,提示不同的土贝母皂苷对肿瘤细胞的作用方式可能有所差异。通过荷瘤小鼠的肿瘤抑制实验,可以观察到土贝母皂苷在体内的实际抑制肿瘤的效果。结果表明,土贝母皂苷丙与土贝母皂苷甲比较,在用药浓度低于它时,仍表现出高于皂苷甲的抑瘤活性。与阳性对照环磷酰胺比较显示出相同的抑瘤效果。小鼠的急性毒性实验表明,无论以静脉注射方式还是以腹腔注射方式给药,其LD50值均较小,显示土贝母皂苷有一定的毒性。腹腔注射时,小鼠表现出一定的炎症反应,且毒性比静脉注射时要高。 土贝母皂苷丙抗肿瘤机制研究 肿瘤细胞诱导分化和分化治疗已被证明是一种较有前途的肿瘤治疗新手段。K562细胞株是广泛用于研究细胞分化的细胞模型
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