应用启动子诱捕策略筛选并初步鉴定肺炎链球菌宿主体内诱导基因

【摘要】：肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)是一种常见的革兰阳性条件致病菌,可引起肺炎、中耳炎、菌血症、脑膜炎等严重疾病,在全球有很高的发病率和死亡率。老人、儿童以及艾滋病和先天免疫缺陷的患者是严重 S.pn 感染的高危人群。由于 S.pn 抗生素耐药率的增加和目前疫苗的缺陷性,使得其感染的后果广泛、严重。因此要想从根本上解决 S.pn 的防治问题,就要深入了解其致病的分子机制,为研发新的药物和疫苗提供理论和实验依据。 病原菌侵入宿主体内后,就进入了一个生存竞争的“战场”,为了自身的生存及应对宿主免疫系统的攻击它将调整其基因表达的模式,下调一些非必需基因的表达,上调另一些基因的表达,这些上调的基因是病原菌在宿主体内生存所必需的,它们很可能是致病过程中的关键基因,称之为体内诱导基因(in vivo-induced gene, ivi gene),是潜在的抗生素作用靶点和疫苗候选者。本研究应用基于启动子诱捕策略的体内表达技术(in vivo expression technology,IVET),以肺炎链球菌荚膜合成的关键基因 galU 作为体内报告基因,利用其缺陷体不能合成荚膜多糖,从而不能在宿主体内存活的特点,筛选鉴定肺炎链球菌 ivi 基因。研究内容包括以下三个部分: 1、构建肺炎链球菌荚膜合成的关键基因 galU 缺失的突变体,获得肺炎链球菌荚膜缺陷菌株,并研究其生物学功能,为后续肺炎链球菌体内诱导基因的鉴定提供实验菌株和技术平台。 采用长臂同源多聚酶链式反应(Long flanking homology polymerase chain reaction,LFH-PCR)方法,制备中间为红霉素耐药基因(erm),