收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

噬菌体D29在结核病诊断和治疗中的应用

彭丽  
【摘要】: 目的 有效控制结核病的传播需要快速诊断结核病,并根据药物敏感性试验结果制定合理有效的化疗方案。利用噬菌体D29建立噬菌体生物扩增法,用于检测标本中的结核分枝杆菌以及对RFP、INH的敏感性,与传统方法和分子生物学方法进行比较,评价其在我国的临床应用价值。面对耐药结核病的严峻疫情,噬菌体作为一种能专性寄生于分枝杆菌的病毒,具有潜在的药用价值。本研究旨在观察噬菌体D29在体外、体内环境下对结核分枝杆菌的作用,探讨其能否成为一种治疗结核病的新药。 方法 1.对噬菌体D29的大小、形态、增殖周期、保存条件等生物学特性进行系统研究,研制噬菌体生物学扩增法快速诊断结核病的试剂盒,并用模拟临床标本对其进行评价。 2.应用噬菌体生物扩增法检测52株结核分枝杆菌临床株对RFP、INH的敏感性,与比例法和DNA序列分析法进行比较,以评价分析噬菌体生物扩增法在检测结核分枝杆菌药物敏感性方面的临床应用价值。 3.已感染分枝杆菌的小鼠腹腔巨噬细胞随机分为生理盐水组、噬菌体高、中、低剂量组,分别加入生理盐水和不同剂量的噬菌体D29,在24h或48h后对巨噬细胞内的分枝杆菌活菌数量进行测定,并在电子显微镜下观察巨噬细胞内分枝杆菌在噬菌体感染前后的细胞改变。 4.采用皮下攻击法分别建立结核分枝杆菌敏感株豚鼠结核病模型和耐药菌株豚鼠结核病模型,感染成功(PPD皮试转阳)后动物被随机分为对照组、RFP治疗组、噬菌体组和(或)联合化疗组,每组8~16只。分别给予不治疗、RFP 25mg/kg灌胃、噬菌体D29 108 PFU/0.5ml滴鼻、RFP 15 mg/kg +EMB 25 mg/kg + PZA 25 mg/kg +LVFX 6 mg/kg灌胃,每周3次,隔日给药。在治疗中观察动物的活动、体重变化;治疗4周和7周后,每组取3~11只豚鼠进行解剖,进行以下指标观察和检定:①动物一般情况;②脏器肉眼病变程度;③脏器重量指数;④脏器病理组织学检查;⑤肺脏和脾脏结核分枝杆菌的定量培养;⑥并在治疗前、治疗后的不同时间点采取血清,测定血清中噬菌体中和抗体的滴度;⑦ELISA法检测血清IL-2、IL-4、IFN-γ含量。 结果 1.噬菌体D29是一种裂解性分枝杆菌噬菌体,病毒颗粒呈类圆形,在75~150 nm之间。宿主菌包括耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌,在耻垢分枝杆菌中的增殖周期为90~180 min,在结核分枝杆菌中的增殖周期为3~6 h以上。 2.噬菌体以液体形式4℃保存无论采用何种保护剂,28周后噬菌体效价下降低于101。-70℃液体保存和冷冻干燥法4℃、室温、37℃保存,依据不同保护剂保存效果相差较大。其中采用无细胞耻垢分枝杆菌菌苗作为保护剂,冻干后室温或4℃保存时,28周内效价仅下降101,较为理想。 3.噬菌体生物扩增法(PhaB法)能鉴别结核分枝杆菌与呼吸道常见的其它致病菌。与改良L-J培养法相比,PhaB法检测痰标本中结核分枝杆菌的敏感度、特异度和符合率分别为86.2%、66.7%、84.4%,在48~72h内出结果。PhaB法检测标本中结核分枝杆菌的最低检出菌量约100 CFU(相当于100条菌/ml),可检测标本中微量结核分枝杆菌。 4.以传统改良L-J比例法药敏结果作为金标准,PhaB法检测结核分枝杆菌RFP耐药性的敏感度为94.1%,特异度为94.4%,符合率为94.2%;PhaB法检测INH耐药性的敏感度为92.1%,特异度为78.6%,符合率为88.5%。DNA序列分析法检测RFP耐药性的敏感度、特异度、符合率分别为82.4%、100%、88.5%; DNA序列分析法检测INH耐药性的敏感度、特异度、符合率分别为85.7%、100%、88.5%。 5.已感染耻垢分枝杆菌的巨噬细胞在吞噬噬菌体D29 24 h后,噬菌体高、中剂量组的巨噬细胞内活菌数量显著低于生理盐水对照组(p0.05),噬菌体低剂量组低于对照组(p 0.05)。电镜下可见噬菌体D29感染巨噬细胞内的耻垢分枝杆菌,并合成子代噬菌体,裂解耻垢分枝杆菌。噬菌体D29对巨噬细胞内的耻垢分枝杆菌有明显裂解作用。 6.已感染结核分枝杆菌的巨噬细胞在吞噬噬菌体D29 24 h、48 h后,噬菌体高、中剂量组的巨噬细胞内活菌数量均显著低于生理盐水对照组(p0.05),噬菌体低剂量组低于对照组(p0.05),各组24 h活菌数量高于48 h活菌数量。表明噬菌体D29对巨噬细胞内结核分枝杆菌有较强的裂解抑制作用。 7.采用噬菌体、RFP治疗4周后敏感菌株豚鼠结核病模型的脏器病变指数显著低于对照组(p0.05),噬菌体组的肺脏荷菌量显著低于对照组(p0.05),RFP组的肺脏荷菌量低于对照组(p0.05)。7周后,噬菌体组的脾脏荷菌量显著低于对照组(p0.05),RFP组与对照组没有统计学差异(p0.05)。病理组织学结果显示:敏感菌株结核病模型噬菌体组豚鼠的肺脏以纤维化为主;脾脏很少有干酪样坏死,以增生结节为主。对照组肺脏见大量Langhans细胞,以增生结节为主;脾脏较多干酪样坏死。表明噬菌体D29对结核病模型有治疗作用。 8.敏感菌株结核病模型采用RFP或噬菌体治疗4周后,血清中IL-2含量高于对照组,但没有显著性差异(p0.05);耐药菌株结核病模型中RFP组、噬菌体组和联合化疗组的IL-2含量均高于对照组,其中噬菌体组含量最高,有统计学意义(p0.05)。各组的IL-4、IFN-γ含量均无显著性差异。表明噬菌体D29可能有增强豚鼠的细胞免疫功能的作用。 9.噬菌体治疗前豚鼠的血清中无噬菌体中和抗体,治疗18天后开始产生,滴度随着治疗时间的延长而增加。 10. RFP组、联合化疗组豚鼠在开始治疗的前期(4周内),活动、进食量明显低于对照组和噬菌体组,其中耐药结核病的联合化疗组死亡2只,RFP组死亡1只。RFP组、联合化疗组在给药4周后的体重增长量显著低于对照组(p0.05),噬菌体组与对照组没有差异(p0.05)。RFP组和联合化疗组的病理组织学检查存在肝内胆红素沉积,噬菌体组不存在任何结核病以外的其他病变。表明噬菌体治疗不影响动物的生长发育,无毒副作用,较为安全。 结论 1.噬菌体生产、保存方便,PhaB法可在48 h内快速检测标本中的结核分枝杆菌活菌,并且具有以试剂盒形式进行商业化生产的可行性,价廉、操作方便,有助于临床结核病的快速诊断。 2. PhaB法是一种操作简便、快速、敏感、与比例法符合率高的药敏试验方法,在48~72h内可获知结核分枝杆菌的药敏结果,费用明显低于同样具有快速、敏感性高特点的分子生物学方法,在我国较分子生物学方法更具有良好的广泛临床应用前景。 3.噬菌体D29可以减少体外生长的巨噬细胞内的耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌的活菌数量,证实具有杀灭巨噬细胞内宿主菌的能力,具有治疗结核病的可能。 4.噬菌体D29可减轻结核病豚鼠的脏器病变程度和脏器荷菌量,具有与RFP接近,甚至更好的疗效,对豚鼠没有副作用,有希望作为新型抗结核药物的开发对象。 5.噬菌体可刺激豚鼠产生噬菌体中和抗体,降低噬菌体D29杀灭结核分枝杆菌的作用。但也可上调机体的细胞免疫功能,增强其抗结核病的能力。 6.综上所述,利用噬菌体D29建立的PhaB法可快速诊断结核病,并为临床提供可靠的药敏试验结果,以便及时制定合理、有效的化疗方案,减少耐药结核病的传播。噬菌体D29还具有成为一种新型抗结核药物的可能,本研究为进一步开发噬菌体提供了实验依据,但在给药系统方面还应进行改进,以便获得更佳的疗效。


知网文化
【相似文献】
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 温占波;王洁;赵建军;杨文惠;于龙;李娜;鹿建春;李劲松;;分枝杆菌噬菌体D29气溶胶特性的研究[A];中国颗粒学会第六届学术年会暨海峡两岸颗粒技术研讨会论文集(下)[C];2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 梁梅;噬菌体D29在小鼠体内的代谢分布和对气道上皮细胞的影响[D];重庆医科大学;2012年
2 张红梅;分枝杆菌噬菌体D29与巨噬细胞的相互作用及其分布研究[D];重庆医科大学;2012年
3 熊玉霞;分支杆菌噬菌体D29裂解酶gp10的克隆表达及抗菌活性鉴定[D];重庆医科大学;2011年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978