收藏本站
《重庆医科大学》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

轮状病毒感染动物模型建立及其发病机制研究

陈军华  
【摘要】: 目的轮状病毒(Rotavirus, RV)是引起婴幼儿腹泻的最主要病原,同时也可引起肠外脏器损害,致病率及病死率均较高,但目前对其发病机制仍未完全清楚,也未能研制出很满意的疫苗。本实验通过猴RV SA-11感染生后7天昆明乳鼠,建立RV感染的乳鼠动物模型,并用该动物模型研究轮状病毒腹泻及肠外脏器损伤发病机制,为RV疫苗研制及更好地防治RV感染提供理论依据。 方法以恒河猴胚肾细胞(MA-104)培养猴RV SA-11,扩增,空斑实验滴定病毒滴度,分装,-80℃保存备用。实验动物选用生后7天清洁级昆明乳鼠,实验组每只乳鼠经口接种0.1 ml病毒培养细胞冻融液(RV含量为3.75×10~7 PFU/ml),而对照组每只乳鼠经口接种0.1 ml正常无病毒对照培养细胞冻融液。感染后1~7天(Day Post Inoculation,DPI),每日观察乳鼠活动情况、毛色光泽、大便变化、体重变化,并收集大便经ELISA检测其中RV抗原,空斑实验滴定其中RV滴度,建立轮状病毒感染动物模型。在1、2、3、4、7、10、15 DPI各时间点取小肠组织,苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin,HE)染色光镜下观察形态学改变,并用图像分析软件(Image pro plus 5.1, IPP5.1)测定空肠绒毛高度和隐窝深度;取3 DPI空肠组织2.5%戊二醛固定后送电镜切片观察肠上皮细胞超形结构改变;取3 DPI空肠石蜡切片用免疫组化染色观察乳鼠空肠RV抗原分布;取1、2、3、4、10、15 DPI空肠石蜡切片用Phalloidine-TRITC染色观察小肠绒毛丝状肌动蛋白分布并用IPP5.1测量、SAS软件统计分析;取3 DPI空肠石蜡切片用Tunnel法检测肠上皮细胞原位凋亡,以研究RV肠炎腹泻发病机制。取3 DPI乳鼠脑、肺、心、胰、肝、肾组织,石蜡切片HE染色光镜和电镜观察病理改变;用免疫荧光法检测RV抗原在各脏器分布;以Phalloidine-TRITC染色观察1、2、3、4 DPI乳鼠心脏丝状肌动蛋白分布并用IPP5.1测量、SAS软件统计分析;用Tunnel法检测3 DPI乳鼠肝脏和心脏原位细胞凋亡;以巢式RT-PCR(nested reverse transcription polymerase reaction ,nRT-PCR)法检测组织中RV RNA分布,以研究RV感染肠外脏器损伤机制。 结果RV SA-11在MA-104细胞内增殖良好,感染后1天即可出现病变,表现为拉网、细胞圆缩、脱落,4天病变可达到+++~++++。空斑实验滴定所收集的病毒液,滴度为3.75×10~7噬斑形成单位(Plaque Forming Unit,PFU)/ml。 RV感染后乳鼠出现腹泻,活动减少,皮毛光泽差,肛周可见粪便污染。腹泻潜伏期为1~5天,持续约1~5天,感染后第3~4天腹泻最重,感染后第8天所有乳鼠停止腹泻。感染后乳鼠大便RV抗原阳性且便中有病毒排出,1~7 DPI大便RV滴定结果依次为3.75×103、6.25×10~3、1.25×10~4、5.00×10~4、6.25×10~3、8.75×10~3、8.75×10~2 PFU/ml,乳鼠腹泻越严重,其大便RV滴度也越高。RV腹泻对乳鼠体重未见明显影响。 乳鼠感染RV后光镜下见小肠肠壁和绒毛轻度充血水肿,绒毛萎缩,绒毛上皮细胞广泛空泡状变性,未见有明显炎性细胞浸润及肠壁坏死等表现。电镜下见绒毛上皮细胞空泡变性部位呈大量脂滴样结构,微绒毛排列紊乱或脱落,而细胞间连结未见明显结构改变。1、2、3、4、7、10、15DPI空肠石蜡切片HE染色并经IPP5.1测量及SAS软件统计分析显示:RV感染后实验组和对照组空肠绒毛高度比较1、2 DPI有统计学意义(P0.05),提示绒毛有萎缩;2、3、4 DPI可见两组肠隐窝深度有差异(P0.05),实验组肠隐窝增生明显;1、2、3、4 DPI肠绒毛高度和肠隐窝深度比值有差异(P0.05),表明其后绒毛上皮增生趋于正常。免疫组化检测提示RV抗原分布主要在小肠绒毛的上部。Palloidine丝状肌动蛋白染色显示1、2 DPI时实验组乳鼠空肠组织丝状肌动蛋白含量有明显减少,但其后则两组无显著差异。原位细胞凋亡检测显示RV感染后空肠上皮细胞凋亡增加。 3 DPI时取乳鼠脑、肺、心、肝、胰、肾组织,光镜下显示轻度心肌间质性水肿、轻度心肌细胞浊肿,肝组织轻度充血、肝细胞空泡样变性,肾小球和肾间质轻度充血、肾小管轻度浊肿,而脑、肺、胰未见明显改变。电镜下见心肌细胞肌丝溶解,滑面内质网扩张,线粒体内室肿胀,核周间隙增宽。免疫组化显示除脑组织外,肺、心、肝、胰、肾组织中均检测到RV抗原。Phalloidine丝状肌动蛋白染色显示1、2、3、4 DPI心肌丝状肌动蛋白含量改变不明显。原位细胞凋亡检测显示肝细胞凋亡明显,而心肌细胞未见明显凋亡。nRT-PCR检测显示脑、肺、心、肝、胰、肾组织中均检测到RV核酸。 结论RV感染昆明乳鼠动物模型建立成功。RV主要感染小肠成熟绒毛上皮细胞。腹泻的发生与小肠绒毛上皮细胞骨架损害、微绒毛损害、细胞凋亡脱落和绒毛萎缩相关,但与肠上皮细胞间连接损害关系不大。RV可由肠道向全身播散,并造成肠外多脏器不同程度损害。造成肠外脏器损害的机制不除外病毒局部增殖破坏组织的可能,也可能由于病毒结构蛋白或非结构蛋白作用造成,如影响丝状肌动蛋白合成,破坏细胞骨架等。病毒感染引起细胞凋亡增加也是造成肠外脏器损害的机制之一。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R-332;R725.1

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前9条
1 姚英民;欧巧群;陈瑶;;人类轮状病毒感染新生小鼠肠道外组织超微结构的变化[J];南方医科大学学报;2006年09期
2 王鹏雁,陈创夫;猪轮状病毒的细胞培养[J];石河子大学学报(自然科学版);2002年04期
3 朱章华;;小儿轮状病毒肠炎致肠道外损害76例分析[J];现代医药卫生;2006年05期
4 宋岩,魏丽丽,程志;人轮状病毒HRB-02株的分离鉴定[J];微生物学杂志;2005年01期
5 杨美芬;侯宗柳;黄永坤;李海林;;轮状病毒感染成年鼠肠外症状的实验研究[J];中国微生态学杂志;2006年05期
6 陈淑红,王新生,师东方,李一经;猪轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究[J];中国预防兽医学报;2004年01期
7 纪绍忠,毕烨,杨红彦,杨凤蓉,宋俊其,陶小霞,崔晓英;引起成人腹泻的新轮状病毒在原代人胚肾细胞上的培养和传代[J];中华医学杂志;2002年01期
8 姚英民!510515,欧巧群!510515,李宁!510515;轮状病毒胃肠炎伴病毒血症急性溶血一例[J];中华儿科杂志;2001年02期
9 姚英民;欧巧群;陈瑶;;人类轮状病毒感染新生小鼠肠道外组织的病理变化[J];中国人兽共患病学报;2006年07期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 魏文;小儿轮状病毒感染的临床探讨[J];安徽卫生职业技术学院学报;2004年04期
2 陈爱贞,何丽红;婴幼儿轮状病毒肠炎的心肌酶谱改变[J];蚌埠医学院学报;2005年01期
3 蒋盛军;纪绍忠;唐青;杨红彦;崔晓英;毕烨;阚飙;高守一;;新成人腹泻轮状病毒J19株VP2、VP3的编码基因序列分析[J];病毒学报;2006年03期
4 蒋盛军;纪绍忠;唐青;杨红彦;崔晓英;毕烨;阚飙;高守一;;新成人腹泻轮状病毒J19株的全基因组克隆和VP4、VP6和VP7基因序列分析[J];病毒学报;2006年06期
5 罗燕芬,关德华,王丽霞;187例感染性腹泻患儿血清心肌酶谱的检测观察[J];北京医学;2001年05期
6 李宁,姚英民,王志远;轮状病毒腹泻患儿病毒血症和肠道外脏器感染的研究(英文)[J];第一军医大学学报;2003年07期
7 姚英民;欧巧群;陈瑶;;人类轮状病毒感染新生小鼠肠道外组织超微结构的变化[J];南方医科大学学报;2006年09期
8 李军黎;轮状病毒肠炎血清心肌酶谱的改变及意义[J];国际医药卫生导报;2005年20期
9 龙晓玲,付四毛,张志培;轮状病毒性肠炎肠道外表现的分析与处理[J];湖南医学;2001年04期
10 岳伟,史鸽,李呈瑾;小儿轮状病毒腹泻合并多系统器官感染的临床分析[J];河南医药信息;2002年08期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 黄小波;猪传染性胃肠炎检测基因芯片与猪传染性胃肠炎病毒SC-H株N基因表达研究[D];四川农业大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李宁;轮状病毒腹泻患儿病毒血症与肠道外脏器感染的研究[D];第一军医大学;2000年
2 欧巧群;轮状病毒肠道外感染发病机制的初步探讨[D];第一军医大学;2001年
3 沈蕙;婴幼儿轮状病毒腹泻临床流行病学研究[D];苏州大学;2003年
4 王志宇;轮状病毒检测技术研究[D];山东大学;2005年
5 栾婧婧;犊牛轮状病毒的分离鉴定及快速诊断方法的建立[D];山东农业大学;2006年
6 毛玉杰;猪A组轮状病毒Vp7基因植物表达载体的构建及转基因植物的研究[D];吉林农业大学;2006年
7 陈强;B组轮状病毒核酸杂交检测方法的建立及其初步应用[D];华中师范大学;2007年
8 胡英会;B组轮状病毒WH-2株vp7基因的原核表达及抗体的制备[D];华中师范大学;2007年
9 彭广东;鸭肿头败血症病毒XD株的鸭胚原代细胞培养特性及免疫电镜观察研究[D];四川农业大学;2007年
10 徐璐;猪轮状病毒培养感染研究与间接夹心ELISA诊断方法的建立[D];四川农业大学;2007年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 宋京翔,王烈,涂小煌,卿三华,邹忠东,林瑞娇,方碧英;精氨酸增强的胃肠外营养在结直肠癌病人中的应用及临床意义[J];肠外与肠内营养;2003年03期
2 叶新华;金玉;方肇寅;;轮状病毒腹泻的社会负担及疫苗的研究进展[J];国际病毒学杂志;2006年04期
3 金玉,薛立军;轮状病毒性肠炎粪便中SIgA水平的变化[J];小儿急救医学;2004年02期
4 黄维真,李颖丰,黄鹂,欧珊;婴幼儿轮状病毒感染与肠道菌群的变化[J];中国热带医学;2005年05期
5 翁维楷,沈梅芬,肖祥熊,朱玉华,张汝慧;正常儿童和急性菌痢儿童粪便中分泌型IgA含量的观察[J];现代免疫学;1983年03期
6 赵荣平,邬叶红,戴军;粪便中乳铁蛋白测定在感染性腹泻诊断中的临床意义[J];检验医学;2004年04期
7 王菊花;薛秀恒;刘光林;鲁瑞东;;共轭亚油酸对断奶仔猪生产性能及免疫的影响[J];中国饲料;2006年02期
8 张巍,员克明,韩德五;甘氨酸防治大鼠肠源性内毒素血症机制研究[J];山西医科大学学报;2003年02期
9 张莉莉,王恬;饲粮蛋白质对早期断奶仔猪腹泻的影响[J];动物科学与动物医学;2002年06期
10 陈尔真,曹伟新,燕敏,费旭峰,陈雪华;丁酸对人结肠癌细胞株SW1116增殖及分化状态的影响[J];外科理论与实践;2003年03期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 鄢华;赖氨酸缺乏对幼建鲤肠道菌群、消化酶活力和免疫功能的影响[D];四川农业大学;2007年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王长安,胡超文,黄发利,陈湘,洪涛;在我国患急性腹泻成人中发现一种新轮状病毒[J];病毒学报;1987年04期
2 李昌仁;王君伟;李英霞;宣世伟;刘宝会;王红;;黑龙江省犊牛腹泻粪便中轮状病毒的分离与鉴定[J];东北农业大学学报;1990年01期
3 李宁,姚英民,温淑娟;轮状病毒腹泻患儿病毒血症的初步研究[J];第一军医大学学报;2001年04期
4 姚英民,欧巧群,李宁;免疫低下小鼠轮状病毒肠道外感染的实验研究[J];第一军医大学学报;2004年11期
5 李国平,伊顺仁,李发晟,周伦江;仔猪轮状病毒的感染情况调查[J];福建畜牧兽医;1999年02期
6 鲍兴儿,沈辉君;轮状病毒肠炎的肠道外表现[J];实用儿科临床杂志;2002年06期
7 彭世勇,王健伟,温乐英,何金生,洪涛;人类轮状病毒基因DNA免疫的初步研究[J];中国病毒学;2002年01期
8 陈淑芬,孟宗达,张志珍,于秋丽,牛建章,张忠,刘玉欣,张书香,卢晓东,杨红彦,周明河;新型B组轮状病毒引起腹泻暴发的初步报告[J];中国公共卫生;1998年03期
9 李嘉琦,刘晓,熊新宇,陈瑜娜,陈元鼎;轮状病毒感染成年小鼠的研究[J];中国实验动物学报;2004年04期
10 李旭!519000,赵源!519000;轮状病毒性肠炎并血小板减少性紫癜一例[J];中华儿科杂志;1999年12期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 罗满林;;犊牛腹泻的被动免疫:用产肠毒素性大肠杆菌 K99抗原和轮状病毒预防接种[J];国际生物制品学杂志;1983年03期
2 ;我国一些轮状病毒株的血清型和亚组鉴定[J];中国人兽共患病杂志;1988年02期
3 金天华;张萍;吴石生;丁力;凌昆;童世荣;;一起冬季婴幼儿腹泻病原学调查[J];云南医药;1989年04期
4 王国梅;添加CaCl_2可提高轮状病毒血清分型ELISA的敏感性[J];国际生物制品学杂志;1993年01期
5 李应光,薛平安;轮状病毒流行病学研究现状[J];泰山医学院学报;1995年02期
6 龙中儿,杨宁生;小儿轮状病毒胃肠炎腹泻的被动免疫防治[J];生物学杂志;1996年03期
7 高明;轮状病毒基因重配研究现状[J];微生物学免疫学进展;1996年04期
8 朱应发,张兰瑛;轮状病毒致婴幼儿腹泻300例分析[J];现代医药卫生;2000年04期
9 唐景裕!066400卢龙,方肇寅,郝玉军!066400卢龙,杨辉,宁剑!066400卢龙,齐锦,赵振梅!066400卢龙,章菁,胡海宽!066400卢龙,谢华萍,高凤洁!066400卢龙,林思恩,王秀军!066400卢龙;卢龙县1998年婴幼儿腹泻轮状病毒血清型调查[J];中华实验和临床病毒学杂志;2001年03期
10 钟佩君,胡渊英,顾兰琴;轮状病毒医院感染在儿科医院的调查[J];上海预防医学杂志;2003年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 时洪艳;冯力;孙东波;;轮状病毒引起的仔猪腹泻[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年
2 王江政;张峰;黄永富;;1334例婴幼儿腹泻中轮状病毒检测结果分析[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
3 于国慧;宋文琪;徐樨巍;;北京地区2008-2009年儿童轮状病毒感染性腹泻流行病学研究[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
4 王斌;唐力;刘满清;彭劲松;涂君;杨继红;曾宪启;;武汉地区A组轮状病毒监测情况分析(2002~2003年)[A];生命科学与微生物专辑[C];2004年
5 矣秀芝;;金标免疫斑点法——轮状病毒快速诊断定性试剂盒应用体会[A];玉溪市第八届检验医学学术年会暨科技成果推广会论文汇编[C];2005年
6 刘悦越;刘艳;谷金莲;于洋;国泰;;血清抗轮状病毒IgA诊断试剂的研制[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
7 郝永华;匡治州;许杨;;轮状病毒vp8基因在大肠杆菌中的克隆表达[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2003年学术交流会论文摘要集[C];2003年
8 王春凤;丛彦龙;;轮状病毒疫苗研究现状[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年
9 钱小平;汪惠群;;ELISA法检测轮状病毒抗原在感染性腹泻中的运用[A];应对突发公共卫生事件论坛论文集[C];2005年
10 杨娟;黄永坤;侯宗柳;刘梅;赵亚玲;戚勤;周丽芳;;2007年和2008年腹泻患儿轮状病毒非结构蛋白基因特征的分析[A];中华医学会第十五次全国儿科学术大会论文汇编(上册)[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 文 都;小儿秋季腹泻原是轮状病毒作怪[N];中国中医药报;2004年
2 王文斗;轮状病毒秋冬爱找婴幼儿[N];南方日报;2004年
3 主任医师 刘晓芹;孙儿腹泻拿“秋”问罪?[N];医药经济报;2000年
4 记者 毛文波;法国研制出防治胃肠炎疫苗[N];科技日报;2005年
5 济南市第一人民医院主任医师 王有国;别把秋季腹泻当菌痢[N];健康报;2007年
6 高明;宝宝秋冬腹泻千万不可大意[N];农村医药报(汉);2008年
7 文文;严把婴幼儿“入口”卫生关[N];广东科技报;2008年
8 本报记者 郭静 实习生 贾亚敏 王诗霖 通讯员 肖金;严把“入口关”防秋季小儿腹泻[N];广东科技报;2008年
9 万慎曜;夏季当心幼儿轮状病毒肠炎[N];中国中医药报;2006年
10 陶春祥;轮状病毒肠外损害研究近况[N];中国医药报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 陈军华;轮状病毒感染动物模型建立及其发病机制研究[D];重庆医科大学;2007年
2 张静;轮状病毒分子流行病学调查及脂质体DNA疫苗研究[D];重庆医科大学;2002年
3 李晋涛;人源轮状病毒的转基因马铃薯口服疫苗研究[D];第三军医大学;2003年
4 曾玫;上海地区儿童腹泻轮状病毒感染的临床流行病学研究[D];复旦大学;2003年
5 董江丽;利用转基因苜蓿生产轮状病毒可食用疫苗研究[D];中国农业大学;2005年
6 祝建波;动物腹泻重组抗原基因的克隆与表达及植物疫苗载体的初步研究[D];华南热带农业大学;2006年
7 何海洋;轮状病毒与宿主细胞相互作用的研究[D];第三军医大学;2012年
8 李丹;水中病毒分析方法及水处理过程病毒去除特性研究[D];清华大学;2010年
9 寇晓霞;水体和贝类中食源性病毒分子检测研究及污染调查[D];中国科学院研究生院(武汉病毒研究所);2007年
10 程卫霞;博卡病毒流行病学、致病性及基因进化研究[D];兰州大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 廖炀;重庆地区婴幼儿轮状病毒临床及分子流行病学特征研究[D];重庆医科大学;2010年
2 彭蕊;中国河北省卢龙地区猪C组轮状病毒分子流行病学检测和特性分析[D];吉林大学;2013年
3 杨娟;2007年和2008年10~12月腹泻患儿轮状病毒基因型研究[D];昆明医学院;2010年
4 兰蓓;太原地区五岁以下腹泻住院儿童轮状病毒的分子流行病学研究[D];山西医科大学;2010年
5 张喆;成人腹泻粪便样品中A组轮状病毒全基因分析[D];华中师范大学;2011年
6 罗灿;广州市白云区某社区轮状病毒、诺如病毒腹泻的监测[D];南方医科大学;2011年
7 雷燕;大熊猫轮状病毒CH-1株基因克隆及分子解析[D];四川农业大学;2011年
8 马慧;儿童轮状病毒和星状病毒的感染情况及其型别分析[D];天津医科大学;2010年
9 文程;HRV间接ELISA检测方法的建立及大庆市区腹泻患儿HRV感染率的调查[D];黑龙江八一农垦大学;2012年
10 赵亚玲;2002年100例秋冬季腹泻患儿轮状病毒分子流行特征的研究[D];昆明医学院;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026