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《重庆医科大学》 2007年
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血清精氨酸代琥珀酸裂解酶活性速率法的建立及临床应用

俸家富  
【摘要】: 肝病为威胁人类健康的主要疾病之一,中国是肝病大国,肝癌是中国恶性肿瘤的第二号“杀手”。全世界每年新增约100万肝癌患者,其中一半发生在中国。单就乙型肝炎而言,全球有三亿多感染者,中国则有一亿五千万之多,近全球一半,占我国总人口的9%以上,其中有1/4是慢性乙型肝炎患者,大约是三千余万,不少因未能诊断出而长期隐匿在正常人群中,严重影响患者本人的生活质量和他人的身体健康。可见肝病对人类的危害,已成为亟待解决的问题。 肝病早期患者多以肝细胞不同程度损伤为主,缺乏明显的临床症状、体征及影像学改变。因此,肝病的早期主要依靠实验诊断,血清酶学检查是其首选指标。据文献报告,至今已研究探讨用于临床诊断肝脏疾病的酶学指标已有几十种,但大多数均因种种原因未被临床医生接受。目前用作反映肝细胞损伤的血清酶,仍主要是丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)。然而,在长期实践中临床医师和检验医学工作者均认识到,在诊断肝病上,ALT和AST的灵敏度尤其是特异性并不令人满意。鉴于此,寻找一种特异性和灵敏度更好的血清标志酶,准确反应肝细胞损伤,有其重要临床实用价值,也有其学术意义。 人体内的尿素几乎全部在肝细胞内生成,精氨酸代琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase,ASL;EC 4.3.2.1)是肝脏合成尿素重要酶之一。ASL主要分布在肝细胞浆中,小肠和肾组织含量少,而心、肺、脾等组织仅微量分布,肌肉组织几乎无此酶活性,故其肝细胞分布特异性较高,是一个很有希望成为反映肝细胞损伤的标志。还有研究表明,ASL是自身免疫性肝病中的一种新的自身抗原,其相应自身抗体是一种高度肝特异性自身抗体,不存在于肝外其他自身免疫性疾病患者的血清或体液中。由此可见,血清ASL可望成为肝细胞损伤的理想标志物。 本研究从分离纯化(Separation and Purification, SP)人肝组织ASL着手,分3部分较系统地对人ASL在组织器官中的分布特点、建立自动生化分析仪测定血清ASL速率法及方法学评价,以及临床诊断肝病的性能进行研究。 第一部分 目的探讨ASL在人体内主要脏器及组织的分布特点,分离纯化肝细胞中ASL。 方法制备人主要的器官或组织匀浆,分别测定各类匀浆中的ASL活性和蛋白浓度,计算其比活性(U/g蛋白);离子交换层析法分离纯化肝细胞ASL,并以SDS-PAGE鉴定纯化产物。 结果在研究的人体器官组织中,肝细胞ASL比活性最高(3.94 U/g蛋白),肾脏次之,约为肝的1/10,脑、心、肠、胰、肺中有少量ASL活性,而其他组织、器官仅微量ASL存在。离子交换层析和透析纯化的产物,电泳仅见单一条带,其分子量约50 kD。 结论证实了ASL在人体内主要存在于肝细胞内,有相对高的肝细胞分布特异性。 第二部分 目的建立适用于自动生化分析仪的ASL活性速率测定法,并进行方法学评价。 方法根据ASL催化的化学反应,以及自动生化分析仪工作特点,建立特异性的偶联酶促反应体系,以正交试验优化反应条件。按国际临床化学学会(IFCC)的有关文件,对建立的方法进行方法学评价,包括精密度、回收率、试剂稳定性、最低检测限、线性范围、干扰试验等。 结果建立了一种新的基于酶偶联反应,以NAD+-NADH为指示系统,可在全自动生化分析仪上测定血清ASL活性的动力学方法。确定了该法的最适底物浓度、pH、反应时间和反应温度等反应条件。方法学评价研究表明,本法的精密度:批内变异系数均值为4.0%(3.6%~4.7%),批间变异系数均值为5.9%(4.0%~8.5%),回收率是100.5%(93.3%~107.2%),在0~167.7 U/L间有良好的线性范围,最低检测限为0 U/L。干扰试验提示:胆红素342μmol/L不会,草酸钠、K2EDTA、Na2EDTA、柠檬酸钠、肝素锂和肝素钠抗凝剂在抗凝浓度内不会产生干扰,Hb0.06 g/L时产生明显干扰。试剂贮存于2~8℃,20周内稳定。 结论成功建立了适用于自动生化分析仪完成的ASL活性速率测定法,该法具有检测速度快、线性范围较宽、样本用量小、特异性和敏感性较高,完全适合临床实验室应用的特点。 第三部分 目的应用建立的ASL活性自动分析方法,探讨血清ASL活性测定对常见的各种肝病的临床诊断性能。 方法对291例肝病患者,包括31例急性肝病患者、165例慢性肝病患者(慢性乙肝患者73例、慢性丙肝患者39例、酒精性肝炎患者25例、药物性肝炎患者16例和自身免疫性肝炎患者12例)、肝硬化患者67例、肝癌患者28例;排除了肝病的其他疾病患者247例,健康人32例,分别采集血样制备血清。测定血清ASL和传统的肝病酶学指标ALT、AST、GGT、LDH及ALP活性,以及TBil水平。慢性肝病组还测定了胱抑素C(cystatin C, CysC)和金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)浓度。肝病组中31例患者进行了肝脏病理组织学检查。按循证检验医学原则,对上述指标的诊断性能进行比较评价。对4例不同肝病患者进行了追踪观察。 结果方差分析显示,非肝病疾病组ASL活性与对照组无显著改变(F=1.108,P=0.355)。而其他肝病酶学指标及总胆红素与对照组比较,均有显著差异(均P 0.05或P 0.01)。与健康对照相比较,ASL活性在各类肝病患者均有19倍以上的升高,活性范围与健康对照组完全无重叠;而ALT和AST除在急性肝炎组分别有25、19倍的升高外,其他肝病组仅有1.5~4倍增加,活性范围与健康对照组存在部分重叠。ASL升高的程度依次是肝癌急性肝炎肝硬化慢性肝炎。慢性肝病组ASL活性与非肝病组及健康对照之间完全无重叠。但ALT和AST则有较大重叠。接收者操作特征曲线(ROC曲线)显示,ASL(以8 U/L为分界值)对诊断肝病总的敏感度为99.7%,特异性为97.8%;ALT和AST则分别为97.6%和33.3%,83.8%和36.5%。ROC曲线下面积(95%可信限)ASL为1.000(0.999~1.000);ALT和AST(均以40 U/L为分界值)则分别为0.755(0.716~0.793)和0.686(0.643~0.729)。对诊断慢性肝病,ASL的敏感度为99.4%,特异性为97.8%,曲线下面积约为1.00 (0.999~1.000);而ALT敏感度为63.6%,特异性为34.1%;AST敏感度为61.8%,特异性为37.3%。曲线下面积ALT和AST分别仅是0.556 (0.498~0.631)和0.545 (0.488~0.602)。 与肝病理组织学检查结果相关性分析表明,ASL浓度(86.9±26.5)与炎症活动度计分(9.83±3.36)呈正相关(r=0.417, P=0.019)。Pearson相关分析显示,ASL与CysC和TIMPs在肝纤维化患者中均呈正相关。追踪观察发现,血清ASL活性的变化,与不同肝病的病理变化进程及病毒性肝炎的感染程度相关。 结论血清ASL活性是反映肝细胞损伤的特异、灵敏指标,对肝病的诊断性能明显优于传统的ALT、AST等肝病酶学指标。血清ASL活性测定有望成为肝病的诊断指标,在临床推广应用。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R446.1

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【参考文献】
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