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《重庆医科大学》 2007年
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TCRγδT细胞在慢性乙型肝炎免疫发病机理中的作用研究

陈敏  
【摘要】: 目的:慢性乙型肝炎作为一种我国常见的慢性传染病,严重地危害着国民的生命健康。机体的免疫功能在机体清除HBV的过程中发挥着重要的作用。目前TCRγδ+T(γδT)细胞与慢性乙型肝炎的关系还研究甚少,因此本研究以慢性HBV感染者为研究对象,以健康者作对照,探讨外周血或肝穿组织的γδT等细胞是否有差异,分析与其它免疫细胞及临床指标是否有相关性;同时观察分离及刺激的γδT细胞在体外的免疫功能。为了解γδT细胞在慢性乙型肝炎免疫发病机理中的作用提供一些实验基础和依据。 方法: 1.外周血γδT细胞与机体的免疫或临床状态的相关性研究:用流式细胞分析法,检测40例慢性无症状HBV携带者(AsC),30例慢性乙型肝炎(CHB)轻度,50例慢性乙型肝炎(CHB)中度至重度,及24例健康献血员的外周血中γδT/T、δ2T/γδT、CD45RO+γδT/γδT、CD45RO+δ2T/δ2T、CD45RO+T/T、CD4+/T、CD8+/T、NK/lym(淋巴细胞)的细胞比例。以SPSS13.0统计软件分析健康对照及慢性HBV感染者各组间细胞比例的差异是否有显著性;分析慢性HBV感染者各样本的γδT、δ2T、CD45RO+γδT、CD45RO+δ2T的细胞比例是否与免疫细胞CD45RO+ T、CD4+、CD8+、NK等的比例具相关性,及是否与HBV-DNA或肝功具相关性。 2.慢性HBV感染患者肝穿标本γδT细胞的检测与分析:用免疫组织化学方法,检测5例慢性HBV感染患者肝穿标本冰冻切片的γδT细胞。计数10个高倍视野的γδT细胞数,用SPSS13.0软件分析γδT细胞数与外周血的γδT、δ2T细胞数的相关性。 3.外周血γδT细胞的分离、刺激与扩增:外周血经密度梯度离心,2h贴壁及流式细胞阴性分选方法,分离6例慢性HBV感染者、3例健康对照者外周血γδT细胞,分析γδT细胞的纯度及活性。以0.2、0.5、1、2μg/mL anti-Vγδ与50 U/ mL rhIL-2分别刺激扩增γδT细胞14天,观察细胞的状态及数量,确定刺激的最佳浓度与时间。 4.外周血来源的γδT细胞的免疫功能的体外研究: 4.1建立LO2-mock、LO2-HBV细胞模型:EcoRⅠ酶切掉pEcob6质粒内的双拷贝HBV-DNA片段,自身连接作mock对照质粒。以阳离子脂质体转染方法,转染人肝源性非癌细胞LO2,用G418筛选出高效表达HBV相关抗原的抗性细胞克隆。用免疫荧光法、ELISA、AXSYM (Abbott)、FQ-PCR等方法检测LO2、LO2-mock、LO2-HBV细胞内或上清中HBsAg、HBcAg/HBeAg、HBV-DNA的含量;用流式细胞仪检测转染细胞MICA/B的表达。 4.2γδT细胞的免疫功能的体外研究:用ELISA法检测经刺激扩增后的γδT细胞上清的TNF-α、IFN-γ的分泌;用LDH释放法检测γδT细胞对LO2、LO2-mock、LO2-HBV的杀伤作用;比较分析6例慢性HBV感染者与3例健康对照者γδT细胞的免疫功能的差异。 结果: 1.经H检验可知,γδT、CD45RO+γδT细胞比例总体的差异无显著性(P0.05),而δ2T(P0.01)、CD45RO+δ2T(P0.05)比例的差异却有显著性。进一步分割检验,可得健康对照组的δ2T比例与其它组的差异均有显著性(P0.01);CHB中重度组的δ2T比例与其它组的差异有显著性(P0.01);健康对照组的CD45RO+δ2T比例与AsC组及CHB中重度组的差异有显著性(P0.05)。经H检验或F检验可得,健康对照组与AsC组的CD45RO+T(%)的差异有显著性(P0.05);健康对照组与CHB轻度组的NK(%)的差异有显著性(P0.05)。 2.经Spearman相关分析可得,δ2T与γδT细胞比例正相关(P0.05),与CD45RO+γδT、CD45RO+δ2T比例间呈负相关(P0.01);γδT与CD4T比例负相关(P0.01);CD45RO+γδT、CD45RO+δ2T、CD45RO+T比例间高度正相关(P0.01)。同时δ2T比例与ALT、AST、TB均呈显著的负相关(P0.01);而CD45RO+γδT、CD45RO+δ2T与DB呈显著的正相关(P0.05);HBV-DNA不与任一细胞比例相关(P0.05)。 3.从所做的5例肝穿标本看,γδT的计数均较低,平均每个高倍视野仅能见2-3个阳性细胞。经Spearman相关分析,肝穿组织γδT细胞计数与外周血γδT、δ2T细胞数间无相关性(P0.05)。 4.经流式阴性分选后,γδT细胞的纯度从23%提高到71%,细胞活性大于90%;20ml外周血约可分到106左右的γδT细胞。在光镜下观察发现0.2μg/mL浓度的anti-γδ刺激γδT细胞9天较好。 5.经LSCM可观察到,LO2-HBV细胞内HBsAg表达主要位于细胞浆内而HBcAg可于胞核也可位于胞浆内,且HBsAg的荧光强度明显强于HBcAg;LO2-HBV细胞上清的HBsAg/HBeAg为阳性,HBV- DNA为9.67×104 copies/mL。而LO2及LO2-mock细胞均未检测到HBV相关抗原的表达及HBV-DNA。LO2-HBV、LO2-mock、LO2细胞MICA/B的表达(MFI)分别为13.3±0.7、7.4±0.9、4.2±0.6,经F检验,差异具显著性(P0.01)。 6.经ELISA检测,慢性HBV感染者的γδT细胞分泌IFN-γ及TNF-α分别为140.8±82.9pg/mL、129.8±71.5pg/mL,健康对照者的为440.7±172.8pg/mL、233.4±218.0pg/mL。经t检验得,两组的IFN-γ的分泌的差异有显著性(P0.01),而TNF-α无显著性差异(P0.05)。 7.经LDH释放法可检测到,在效靶比为30:1下,慢性HBV感染组对靶细胞LO2、LO2-mock或LO2-HBV的杀伤率为9.98±1.2%、11.05±3.5%、18.1±6.0%;而健康对照组的为16.6±1.04%、18.7±0.98%、31.5±4.16%。经t检验得,两组对三种靶细胞的杀伤能力的差异均具显著性(P0.05);同时LO2与LO2-HBV间,LO2-mock与LO2-HBV间杀伤率的差异有显著性(P0.05)。 结论: 1.慢性HBV感染不会引起外周血γδT细胞比例的显著性改变,但可使δ2T亚型比例降低;慢性HBV感染患者外周血的γδT仍以δ2T细胞亚群为主;CD45RO+δ2T细胞亚群是CD45RO+γδT细胞的主要组成成分。 2.慢性HBV感染患者γδT与CD4比例呈负相关,与特异性CD8T或非特异性NK细胞不成显著相关,提示γδT可能与辅助型T细胞免疫反应相关;慢性乙型肝炎的肝细胞高免疫炎症状态(ALT/AST升高)伴随着外周血δ2T细胞的减少;但HBV-DNA的载量不影响γδT细胞比例。 3.本实验采用流式阴性分选的方法来分离外周血γδT细胞从细胞纯度或活性上分析是基本可行的;获得LO2-mock、LO2-HBV稳定传代细胞株,可用作本实验的靶细胞,也可用于分泌HBV-DNA的转染细胞是否会影响γδT细胞的杀伤功能的实验研究。 4.经刺激的慢性HBV感染者的γδT细胞IFN-γ分泌能力及杀伤LO2、LO2-mock与LO2-HBV的能力均弱于健康对照者,而TNF-α无显著性差异。提示慢性HBV感染者的γδT细胞分泌IFN-γ能力较弱是其杀伤功能低的重要因素。 5. LO2与LO2-HBV,LO2-mock与LO2-HBV间杀伤率的差异有显著性,结合细胞MICA/B分析,提示HBV-DNA的复制或转录可增强细胞MICA/B的表达,进而提高γδT细胞对之的杀伤效应。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R512.62

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【引证文献】
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1 韩聚强;徐小洁;叶棋浓;;γ/δ T细胞与丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒感染[J];生物技术通讯;2012年01期
【参考文献】
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1 李磊,杨东亮,高人焘;乙型肝炎治疗性疫苗研究现状[J];实用肝脏病杂志;2005年04期
2 邹晓毅,姚云清;机体清除乙型肝炎病毒免疫机制研究新进展[J];国外医学.病毒学分册;2005年02期
3 李志群;朱思和;李志恒;成军;马英骥;;非细胞毒性清除乙型肝炎病毒机制的研究[J];国际流行病学传染病学杂志;2006年02期
4 王小路;何维;张连山;;鼻咽癌患者γδT细胞体外扩增及Vδ亚型表达的研究[J];解放军医学杂志;2006年02期
5 郭新珍;王宝恩;;慢性乙型肝炎免疫治疗现状[J];临床肝胆病杂志;2006年06期
6 田志刚,陈永艳,魏海明;肝脏天然免疫系统对HBV感染及肝脏免疫致病的新解释[J];细胞与分子免疫学杂志;2003年04期
7 常莹,陶璐薇,陈孝平,周秀敏,宋宇虎,黄锦,张琼,林菊生;肝癌组织中遗传印记基因PEG10表达的特异性及其意义[J];世界华人消化杂志;2005年12期
8 李静,何维,胡愉;自身免疫病患者外周血γδT细胞系的功能研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2000年01期
9 谭岩;杨贵贞;;γδT细胞[J];中国免疫学杂志;1991年01期
10 陈大为,张鸿飞,王福生;NK/NKT细胞亚群研究进展及其在乙型肝炎中的作用[J];肝脏;2005年03期
【共引文献】
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1 侯彦强,吴俊英,胡建国,李柏青;流式细胞术检测γδT细胞内细胞因子的方法学探讨[J];蚌埠医学院学报;2002年05期
2 杨丽莎;王钊;覃理灵;何武;周劲刚;吴淋玲;黄亚琴;;HBV感染患者不同免疫状态下血清sICAM-1表达的研究[J];重庆医学;2010年23期
3 黄锦;林菊生;董旭旸;常莹;宋宇虎;;PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响[J];第四军医大学学报;2007年03期
4 熊和民;颜太琼;;乙肝疫苗治疗慢性乙型肝炎[J];达州职业技术学院学报;2008年Z2期
5 杨旭伟,吕联煌,黄明清,陈元仲;应用PCR技术检测急性淋巴细胞白血病T细胞受体γ基因重排[J];福建医学院学报;1996年03期
6 张华;骆方军;王丹;;三种免疫状态乙型肝炎患者外周血前S1蛋白的变化[J];放射免疫学杂志;2010年01期
7 顾锡炳;杨小娟;王栋;华忠;徐月琴;陆忠华;;慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平与外周血T淋巴细胞和NK细胞计数的关系[J];实用肝脏病杂志;2010年06期
8 周娟;李连闯;毕明刚;季宇彬;;慢性乙肝的细胞免疫病理和中药与植物药治疗[J];国外医药(植物药分册);2006年05期
9 梁树德;;5种抗病毒药物治疗慢性乙型肝炎的研究[J];应用预防医学;2008年S2期
10 刘辉;罗荣城;孙婷婷;杨小民;李成浩;蔡艳军;;人鼻咽癌吉西他滨耐药细胞系的建立及其生物学特性[J];解放军医学杂志;2007年06期
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1 刘映霞;位兴辉;李兵;罗志雄;谢婧靖;谭艳;龙素军;周伯平;;乙型肝炎病毒C蛋白对NK细胞功能影响的体外研究[A];全国第2届中西医结合传染病学术会议暨国家中医药管理局第1届传染病协作组会议论文汇编[C];2008年
2 杨丽莎;罗伟生;覃理灵;何武;周劲刚;王钊;吴淋玲;黄亚琴;;HBV感染不同免疫状态患者血清中可溶性细胞间粘附分子-1水平的变化[A];第四届中医药继续教育高峰论坛暨中华中医药学会继续教育分会换届选举会议论文集[C];2011年
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1 智联腾;基于候选基因的慢性乙型肝炎及SARS的遗传易感性研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2006年
2 贾户亮;用基因芯片技术寻找新的肝癌早期诊断标记物的研究[D];复旦大学;2006年
3 徐若男;补体C5a在败血症中作用机理研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
4 黄锦;应用RNAi技术沉默遗传印记基因PEG10治疗肝癌的实验研究[D];华中科技大学;2007年
5 龙长江;乙型肝炎免疫模型与仿真[D];华中科技大学;2007年
6 张琼;遗传印记基因PEG10致肿瘤生物学效应的实验研究[D];华中科技大学;2007年
7 张晓伟;DNA甲基化在鼻咽癌紫杉醇耐药形成及逆转耐药机制中的初步研究[D];中南大学;2012年
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1 王钊;HBV感染不同免疫状态与sICAM-1表达的关系[D];桂林医学院;2010年
2 吴淋玲;广西桂北地区慢性HBV感染不同免疫状态与HBV基因型研究[D];桂林医学院;2011年
3 沈文正;CD58对妊娠山羊子宫内膜淋巴细胞分泌活动的影响[D];西北农林科技大学;2001年
4 蒋黎;人鼠嵌合肝动物模型及其感染HBV的初步研究[D];第三军医大学;2004年
5 姜雪强;二草清肝汤抗大鼠免疫性肝损伤的作用机理研究[D];湖北中医学院;2006年
6 张鑫;乙型肝炎病毒X蛋白损害NK细胞功能导致乙型肝炎慢性化机制的研究[D];南华大学;2006年
7 俎燕会;慢性乙肝患者外周血T淋巴细胞亚群分析及Caspase-3活性的相关研究[D];山东大学;2006年
8 李春芝;HD-Ⅰ对乙型病毒性肝炎的免疫调节作用[D];山东大学;2006年
9 张红栓;乙肝扶正排毒胶囊体外抗乙肝病毒及对NF-kb活化干预的实验研究[D];第一军医大学;2006年
10 常莹;遗传印记基因PEG10在肝癌中表达的特异性及其意义[D];华中科技大学;2006年
【二级引证文献】
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1 王晓晶;宁琴;;乙型肝炎重症化的研究现状和展望[J];临床肝胆病杂志;2012年06期
【二级参考文献】
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1 王峰,王英凯,蔡艳俊,潘宝昌,江文成;急、慢性病毒性乙型肝炎病人干扰素-自然杀伤细胞系统功能的研究[J];临床肝胆病杂志;2000年03期
2 于松涛,张芳,何维;抗体固相法体外扩增人肿瘤浸润γδT淋巴细胞[J];免疫学杂志;1997年04期
3 何维,巴德年;γδT细胞的生物学意义[J];上海免疫学杂志;1997年01期
4 谭岩;杨贵贞;;γδT细胞[J];中国免疫学杂志;1991年01期
5 何维,李刚,林颖,于松涛,刘庆丰,杜桂书,李静,巴德年;病原体抗原刺激的正常人外周血CD4~+T细胞对γδT细胞的影响[J];中国医学科学院学报;1997年06期
6 刘建平,秦献魁,Heather McIntosh;中草药治疗慢性乙型肝炎随机对照试验的系统评价[J];中国中西医结合杂志;2002年01期
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1 梁艳丽;梅存金;刘成永;;替比夫定治疗阿德福韦治疗失败的慢性乙型肝炎的疗效[J];现代医药卫生;2009年04期
2 田玉英;;慢性乙型肝炎患者健康教育指导[J];现代中西医结合杂志;2009年10期
3 梁小浣;;慢性乙型肝炎、肝硬化及肝细胞癌患者血清乙型肝炎病毒X蛋白抗体的检测[J];上海医学;1990年06期
4 刘新矿;;拉米夫定治疗84例慢性乙型肝炎患者的临床疗效观察[J];安徽卫生职业技术学院学报;2008年05期
5 罗生强;张玲霞;;恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎的最新进展[J];中国新药杂志;2006年12期
6 谢秋;王建华;牛勃;;树突状细胞与慢性乙型肝炎[J];世界华人消化杂志;2009年11期
7 董胜利;;慢性乙型肝炎治疗临床研究[J];临床医学工程;2010年09期
8 汪莉萍;陈明;封波;张言超;李秀华;;慢性乙型肝炎病毒基因型与血清病毒载量的关系[J];徐州医学院学报;2007年02期
9 邓志华;王桂琴;曹燕;徐永群;王琦;;乙型肝炎病毒基因分型及其临床意义[J];肝脏;2007年06期
10 叶立红;王翀奎;刘莲;赵召霞;杨莉;梅志勤;侯军良;戴二黑;;慢性乙型肝炎患者血清共价闭合环状DNA检测的临床意义[J];现代中西医结合杂志;2010年20期
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1 侯金林;;乙型肝炎e抗原阴性慢性乙型肝炎的研究进展[A];第一届全国疑难重型肝病大会、第四届全国人工肝及血液净化学术年会论文集[C];2008年
2 黄惠宜;;乙型肝炎病毒e系统的转换与慢性肝炎的预后[A];中华医学会全国第九次感染病学学术会议论文汇编[C];2006年
3 董菁;成军;王勤环;王刚;施双双;刘友昭;夏小兵;邵清;斯崇文;;慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒准种特点的初步研究[A];中华医学会第七次全国感染病学术会议论文汇编[C];2001年
4 郑亚江;高月求;王灵台;;慢性乙型肝炎脾虚患者树突细胞的功能变化[A];中华中医药学会第十二届内科肝胆病学术会议暨第四次国家中医肝病重点专科协作组学术会议论文汇编[C];2006年
5 任仲轩;周俊英;裴琇;王麟士;张金花;;乙型肝炎患者YMDD变异对肝功能的影响[A];第五届全国肝脏疾病临床暨中华肝脏病杂志成立十周年学术会议论文汇编[C];2006年
6 蒋理;;慢性乙型肝炎e抗原阴性患者病毒核酸载量与乙型肝炎病毒大蛋白的相关性研究[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
7 周大桥;童光东;;清透法对33例慢性乙型肝炎患者Th1/Th2状态的影响[A];2002全国中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2002年
8 许青田;郝红梅;崔中锋;;慢性乙型肝炎HBV DNA水平与丙氨酸氨基转移酶的关系[A];第五届全国肝脏疾病临床暨中华肝脏病杂志成立十周年学术会议论文汇编[C];2006年
9 林春景;吴金明;黄智铭;吴建胜;;慢性乙型肝炎免疫耐受期患者HBsAg基因多态性研究[A];中华医学会第11届全国内科学术会议论文汇编[C];2007年
10 郑宇;;乙型肝炎病毒基因变异在HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者中的表达[A];第五届全国肝脏疾病临床暨中华肝脏病杂志成立十周年学术会议论文汇编[C];2006年
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1 本报记者 高莎;如何正确治疗慢性乙型肝炎?[N];工人日报;2001年
2 周欣;乙型肝炎病毒检验[N];中国医药报;2003年
3 石家庄市第五医院妇产科副主任、副主任医师 朱宝申;浅谈乙型肝炎病毒的父婴传播[N];石家庄日报;2009年
4 曾历;新研究带来新启示[N];健康报;2008年
5 ;慢性乙型肝炎的用药原则[N];大连日报;2005年
6 石家庄市第五医院感染五科主任 陈翠英;再谈慢性乙型肝炎抗病毒治疗的必要性[N];石家庄日报;2009年
7 剑钟;“丹参酸乙”抗慢性乙型肝炎肝纤维化研究取得重要进展[N];上海中医药报;2002年
8 孙仁渊;治肝病别忽视免疫功能的恢复[N];健康报;2009年
9 汪承柏教授;中西医结合诊治慢性乙型肝炎[N];中国中医药报;2003年
10 汪承柏;中西医结合诊治慢性乙型肝炎[N];中国中医药报;2003年
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1 陈敏;TCRγδT细胞在慢性乙型肝炎免疫发病机理中的作用研究[D];重庆医科大学;2007年
2 于士颜;乙型肝炎病毒多聚酶抑制Ⅰ型干扰素诱生机制的研究[D];复旦大学;2011年
3 纪冬;乙型肝炎病毒多聚酶区基因突变的监测与突变对病毒复制力影响的分析[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
4 张岩;应用RNAi技术抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究[D];第四军医大学;2005年
5 张秋;TRAIL及其相关分子在HBV感染所致凋亡改变中的机制研究[D];山东大学;2005年
6 刘光泽;复制型HBV转基因小鼠的建立、生物学特性、应用及无免疫耐受研究[D];第一军医大学;2007年
7 彭仙娥;乙型肝炎病毒在非酒精脂肪肝发生中的作用及机制研究[D];福建医科大学;2009年
8 潘金水;乙型肝炎病毒包膜蛋白与跳跃断裂易位蛋白相互作用的验证[D];福建医科大学;2009年
9 刘晓颖;肿瘤坏死因子α诱导的cIAP_2蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的研究[D];复旦大学;2005年
10 李进;乙型肝炎病毒X蛋白反式调节作用的研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘金霞;阿德福韦治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎的临床研究[D];山东大学;2005年
2 郑自华;HBeAg阴性慢性乙型肝炎临床特点和相关病毒变异的临床意义[D];暨南大学;2007年
3 辛桂杰;吉林地区HBV基因分型及其与阿地福韦酯的疗效相关性分析[D];吉林大学;2005年
4 王宏图;HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者的临床特征分析[D];昆明医学院;2008年
5 薛源;美洲大蠊提取物治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎的临床研究[D];昆明医学院;2009年
6 沈建坤;实时荧光聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒基因型方法的建立和临床应用[D];第一军医大学;2005年
7 崔明芳;Tim-3基因多态性与HBV感染转归的相关性研究[D];安徽医科大学;2011年
8 夏淑林;CD24基因多态性与慢性HBV感染的遗传易感性研究[D];安徽医科大学;2011年
9 刘琦;HBV基因型及前C区变异与慢性乙型肝炎病情关系研究[D];重庆医科大学;2011年
10 李志军;HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因变异的全基因组分析及其与干扰素α疗效的关系[D];福建医科大学;2010年
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