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《重庆医科大学》 2007年
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青蒿琥酯对K562细胞系CD34~+细胞的作用及分子机制

林雪梅  
【摘要】: 目的 慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一组起源于造血干/祖细胞的恶性克隆增殖性疾患,迄今治疗仍主要采用传统的大剂量联合化疗,但此法副作用大,复发率高,而且对正常机体免疫与造血系统有极大的损害。从祖国医学宝库中寻找出既能抑制白血病细胞恶性增殖、诱导凋亡,副作用又相对较小的天然药物已成为治疗白血病的希望和重要途径。 青蒿素(Artemisinin)是从传统中药分离提取的含特殊过氧基团的倍半萜类物质,青蒿琥酯(artesunate, AST)为其衍生物之一,作为高效抗疟药已广泛应用于临床。近年研究证明:青蒿素类药物对包括K562细胞系在内的多种肿瘤细胞系有确切的抗肿瘤作用。 但现有青蒿素类药物的抗肿瘤研究,还主要存在以下四方面不足:①未涉及到肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)层面;②未见对荷瘤动物模型的影响;③毒理学相关研究较少;④机制不清楚。 据此,我们观察了青蒿琥酯对源于K562细胞系的CD34+白血病干细胞样细胞和脐血CD34+造血干/祖细胞的影响,对荷瘤动物模型的影响,对bcr-abl、BCL-XL mRNA的影响,以达到评价青蒿素类药物药理作用、毒副作用,研究作用机制,并为后续研究青蒿素类药物的临床应用奠定理论与实验基础。 方法 1.采用免疫磁珠阳性筛选法从K562细胞中分选CD34+细胞,应用细胞形态学、流式细胞仪、免疫组化、集落培养、RT-PCR等进行鉴定,运用有限稀释法及细胞因子组合进行纯化和扩增培养。 2.在成功建立K562细胞系CD34+细胞移植性白血病SCID小鼠模型的基础上,通过比较发病情况及生存时间,移植瘤生长情况,外周血白细胞计数及分类,骨髓细胞形态改变及计数,病理学检查,RT-PCR检测组织bcr-abl表达等考察药物对荷瘤小鼠的影响。 3.选用K562细胞系CD34+细胞及脐血CD34+造血干/祖细胞,加入不同浓度的AST。甲基纤维素半固体培养法考察AST对其体外扩增和多向分化能力的影响;应用形态学观察、TUNEL原位检测、流式细胞术Annexin V-FITC加碘化丙啶(PI)双染定量检测细胞凋亡;应用免疫细胞化学染色法等初步探讨AST对细胞分化的作用。 4.通过RT-PCR测定bcr-ablmRNA、Bcl-XLmRNA表达,探讨AST诱导K562细胞系CD34+细胞凋亡的分子机制。 结果 1.K562细胞系CD34+细胞的分离、纯化、鉴定和培养结果显示:分选的K562细胞系CD34+细胞具有一定的白血病干/祖细胞性质,如:始终保持自身一定比例,处于低分化状态,处于G0/G1期细胞的比率较高,成瘤能力强,表达多药耐药基因等。 2. K562细胞系CD34+细胞SCID小鼠移植性白血病模型的建立与鉴定 K562细胞系CD34+细胞能在SCID小鼠成功建立移植性白血病模型;与普通K562细胞相比,K562细胞系CD34+细胞具有更强的成瘤能力。 3.青蒿琥酯对体外培养的K562细胞系CD34+细胞的作用 3.1 AST在12.5~50μg/ml能够剂量依赖性地抑制K562系CD34+细胞CFC的形成;当浓度为50μg/ml时,抑制率达100%。 3.2 AST可剂量及时间依赖性诱导K562系CD34+细胞凋亡。 3.3 AST可能具有诱导K562系CD34+细胞向较成熟粒系细胞分化的趋势。 4.青蒿琥酯对K562细胞系CD34+细胞SCID小鼠移植性白血病模型作用观察 4.1 AST腹腔注射移植性白血病模型SCID小鼠,小鼠一般状况较对照组有明显改善,体重较对照组降低程度变轻,存活时间明显延长。 4.2 AST腹腔注射两周后外周血白细胞数明显减少。 4.3 25mg/ml、50mg/mlAST对移植瘤体的抑制率分别为37.85%、49.66%; 5.青蒿琥酯对脐血造血干/祖细胞的影响 5.1 50μg/mlAST对脐血CD34+HSC/HPC的体外扩增无明显抑制作用。 5.2 50μg/mlAST作用48h、72h,对脐血CD34+造血干/祖细胞无明显诱导凋亡的作用。 6.青蒿琥酯诱导K562细胞系CD34+细胞凋亡的分子机制初步研究AST呈剂量及时间依赖性降低K562细胞系CD34+细胞bcr-abl mRNA、Bcl-XL mRNA的表达 结论 1.体内外实验证实,K562细胞系CD34+细胞具有一定的白血病干/祖细胞性质; 2.青蒿琥酯对体外培养的K562细胞系CD34+细胞有抑制增殖、诱导凋亡的作用,并可能诱导细胞向粒系细胞方向分化; 3.青蒿琥酯对K562细胞系CD34+细胞SCID小鼠移植性白血病模型有一定治疗作用。 4.≤50μg/ml的青蒿琥酯对脐血CD34+细胞的增殖、分化无明显抑制作用,也无明显诱导凋亡的作用。 5.青蒿琥酯对K562细胞系CD34+细胞的作用可能与下调bcr-ablmRNA、Bcl-XL mRNA,启动凋亡有关。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R733.7

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