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《重庆医科大学》 2007年
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肾脏损伤机制及防治药物的筛选和评价

朱深银  
【摘要】: 肾脏是人体内最常见也是最容易损伤的器官之一,除了外力的机械性损伤外,内源性因素如高尿酸血症、糖尿病以及免疫因素等都可以引起严重的肾脏损伤;外源性因素如化学物质、药物等,也是引起肾脏损伤的重要原因。此外肾脏具有两级毛细血管网,血管分布密集,血管功能是维持肾脏功能的重要条件。 高尿酸是近年发现的损伤血管和肾脏功能的重要内源性因素,而二甘醇是导致肾脏损伤的外源性化学物质,但高尿酸和二甘醇对肾脏和血管的损伤作用及针对该损伤的防治药物很少有研究。因此本研究以高尿酸和二甘醇作为肾脏损伤的内源性和外源性物质代表,系统研究其产生损伤的机制,并在此基础上,筛选能够抑制损伤物质生成、促进其排泄、增强肾脏抗损伤作用的活性化合物,并评价其作用和作用机制。 一高尿酸对血管和肾脏损伤作用及抗损伤活性化合物的筛选及评价 高尿酸可损伤血管和肾脏,促发心血管和肾脏疾病。实验建立大鼠高尿酸血症模型,揭示高尿酸对血管和肾脏的病理作用及其作用机制;然后以尿酸生成的关键酶黄嘌呤氧化酶为药物作用的分子靶点,建立黄嘌呤氧化酶抑制剂体外高通量筛选模型,利用此模型进行样品筛选;观察筛选出的活性化合物对尿酸肾脏排泄影响;培养血管细胞和肾小管上皮细胞,观察高尿酸对其病理作用,筛选出有较好保护作用的活性化合物,并探讨其可能的作用机理。实验发现: 1高尿酸血症大鼠血清尿酸水平显著增加,全身血压轻度增加,其离体肠系膜血管床对各剂量KCl和NE收缩反应增强,对各剂量SNP和Ach舒张反应减弱,血清NO水平显著减少,血浆vWF水平显著升高,T-NOS活性显著降低,iNOS活性显著升高,肠系膜血管CRP、MCP-1蛋白表达显著升高,eNOS蛋白表达降低;说明高尿酸对血管具有损伤作用,该损伤作用与血管NOS活性降低、CRP和MCP-1蛋白表达升高以及eNOS蛋白表达降低有关。 2高尿酸血症大鼠血清和肾组织肌酐、尿素氮、NAG和MDA含量显著增加, T-NOS活性显著降低、iNOS活性显著升高,CRP、MCP-1蛋白表达显著升高、eNOS蛋白表达降低;说明高尿酸对肾脏具有损伤作用,该损伤作用与肾脏脂质过氧化反应增加、NOS活性降低、CRP、MCP-1蛋白表达显著升高,eNOS蛋白表达降低有关。 3应用XO抑制剂高通量体外筛选模型筛选71760个样品,发现27个具有较好活性的活性化合物,其中17个有较好量-效关系。 4利用离体肾脏灌流模型评价筛选出的活性化合物对肾功能和肾脏尿酸排泄作用,结果发现化合物J11222( 24.8ug/ml)和DF2956对肾脏具有损伤作用;化合物J11222( 8.27和2.48ug/ml)和J11225能增加尿酸排泄分数和总尿酸排泄量,提示J11222和J11225具有促尿酸排泄作用。 5 FCS 1.5%和尿酸500μmol/L作用血管内皮细胞48 h,能有效抑制其增殖;被筛选的30个中药单体中姜黄素、三七皂苷R1和丹参酮Ⅰ在1-100 uM内对抗尿酸抑制的血管内皮细胞增殖作用呈现明显的剂量依赖性,可促进高尿酸处理的血管内皮细胞NO生成,抑制血管内皮细胞CRP、MCP-1表达、促进eNOS蛋白表达。 6尿酸500μmol/L作用血管平滑肌细胞48 h,能有效诱导其增殖;被筛选的30个中药单体中丹酚酸B、丹参酮Ⅰ、芦丁、姜黄素、阿魏酸、三七皂苷R1、盐酸川芎嗪能较好的抑制尿酸诱导细胞增殖,细胞增殖率小于15%。 7尿酸500μmol/L作用血管外膜成纤维细胞48 h,能有效诱导其增殖;被筛选的30个中药单体中丹酚酸B、丹参酮Ⅰ、姜黄素、阿魏酸、三七皂苷R1、盐酸川芎嗪有较好的抑制尿酸诱导细胞增殖作用,细胞增殖率小于15%。 8尿酸500μmol/L作用人肾近曲小管细胞48 h,能有效诱导其增殖;被筛选的30个中药单体中芦丁、姜黄素、阿魏酸、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、芍药苷有较好的抑制尿酸诱导细胞增殖作用,细胞增殖率小于25%。 由上所得,高尿酸能引起血管和肾脏损伤;从抑制尿酸生成、促进尿酸排泄和抗高尿酸血管和肾脏损伤方面筛选出了一些活性化合物,发现一些中药单体通过改善NO生成,提高NOS活性,改善CRP、MCP-1和eNOS蛋白表达而发挥抗血管和肾脏损伤作用。 二二甘醇对肾脏的损伤作用及抗损伤药物的筛选和评价 二甘醇具有独特的物理性能和化学性能,在工业和日用化学品方面用途十分广泛,时常造成人中毒,而以肾毒性(急性肾功能衰竭)为主要表现。本研究以二甘醇的肾毒性为研究内容,观察二甘醇对离体肾脏、小鼠、血管内皮细胞和肾近曲小管细胞的毒性及药物干预作用,为肾脏外源性物质损伤研究提供实验模型和二甘醇中毒的药物干预提供实验依据。结果发现: 1发现二甘醇能增加离体肾脏灌流压力、尿蛋白含量、尿量和肾脏MDA含量,对肾小球滤过率无影响,提示二甘醇能损伤肾脏血管和肾小管,该损伤与其诱发肾脏脂质过氧化反应有关。 2二甘醇中毒后,小鼠肝指数降低、肾指数增加,血液肌酐和尿素水平升高;肝脏和肾脏组织SOD和GSH-PX活性降低、MDA含量增加;大黄和泽泻提取物具有一定的改善作用,该作用与改善抗氧化酶活性及抑制脂质过氧化反应有关。 3 DEG对血管内皮细胞损伤具有剂量和时间依赖性,DEG 400μmol/L作用血管内皮细胞24 h,能明显损伤细胞;被筛选的30个中药单体中丹酚酸A,丹参酮ⅡA,,黄芪甲苷,金丝桃苷,槲皮素,人参皂苷Rb1能改善DEG对血管内皮细胞的损伤,保护率大于10%。 4 DEG对人肾近球小管细胞损伤具有剂量和时间依赖性,DEG 400μmol/L作用肾近曲小管细胞24 h,对细胞造成明显损伤;筛选的30个中药单体中丹酚酸B,隐丹参酮,黄芪甲苷,槲皮素,姜黄素,原花青素能改善DEG损伤的细胞活力,具有较好的保护作用,保护率大于60%。 综上所述,二甘醇能引起肾脏损伤,其毒性靶部位可能是肾脏血管和肾小管,一些中药能改善其对血管和肾小管细胞的损伤。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R965.1

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