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《重庆医科大学》 2007年
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人胱抑素C抗体制备和检测方法建立及其方法学评价

陈婷梅  
【摘要】: 胱抑素C (cystatin C, Cys C)即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白,其血清浓度测定是优于传统的血尿素、尿酸、肌酐和内生肌酐清除率测定的新的肾功能评价指标。2002年FDA网上公布了26个在检验医学有重大突破的全新检测项目,血清(浆)Cys C测定便是其中之一。但目前临床试验室测定Cys C均为需要昂贵特殊仪器和试剂盒的方法,制约了其推广应用。 目的: 构建人Cys C的原核表达载体,将纯化的Cys C重组蛋白免疫大白兔,制备Cys C抗血清,为建立Cys C的检测方法奠定基础;用自制的Cys C抗血清,建立可在自动生化分析仪上定量测定血清Cys C的颗粒增强透射免疫分析法( particle enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA),并进行方法学评价,,为该法的临床应用奠定基础;用纯化的重组Cys C蛋白免疫Balb/c小鼠,制备Cys C单克隆抗体,为进一步建立Cys C其他免疫学测定方法,以及研究Cys C的其他生物学作用和机制提供基础。 方法: 1.采用RT-PCR技术,从细胞中扩增Cys C目的基因,并将其克隆到pET32a(+)原核表达载体,构建重组Cys C原核表达质粒pET32a(+)/Cys C。 2.将构建的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导重组蛋白表达,表达蛋白经镍离子亲和层析系统纯化,并进行鉴定。 3.用纯化重组蛋白免疫大白兔,制备Cys C抗血清。 4.采用自制提纯的Cys C抗血清包被乳胶颗粒,建立可在自动生化分析仪上定量测定Cys C的PETIA,并将此法与进口商品化试剂盒进行比对实验,以及进行准确度、精密度、线性范围、检测限、干扰试验等方法学评价试验。 5.用纯化重组的Cys C蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经过克隆化和筛选,建立稳定分泌抗Cys C的杂交瘤细胞株,并通过动物体内诱生腹水大量制备单克隆抗体。 结果: 1.经基因克隆及重组技术,获得了35 kD的Cys C融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体,此包涵体蛋白经Ni2+亲和层析能有效纯化;以该蛋白免疫大白兔制备了Cys C抗血清。 2.采用自制提纯的Cys C抗血清包被乳胶颗粒,建立了可在自动生化分析仪上定量测定Cys C的PETIA,方法学评价实验显示该法具有较好的检测性能指标,并与进口的商品试剂盒有很好的可比性,符合临床应用要求。 3.采用杂交瘤技术,建立了稳定分泌抗Cys C单克隆抗体的2株杂交瘤细胞株,将其中1株细胞注射于小鼠腹腔,得到了富含Cys C单克隆抗体的小鼠腹水。 结论: 1.经基因重组技术获得了35 kD的Cys C融合蛋白,利用此蛋白抗原制备得到兔抗人Cys C抗血清(多克隆抗体),并成功制备了鼠抗人Cys C单克隆抗体。 2.采用自制的Cys C抗血清,建立了在自动生化分析仪上定量测定Cys C的PETIA,该法具有较好的性能指标,与商品化进口试剂盒有很好的可比性,符合临床应用要求。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R446.6

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