乙型肝炎病毒正链负性调节元件的鉴定与功能研究

【摘要】： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染人体后将导致急、慢性乙型肝炎,部分患者演变为肝硬化,甚至肝细胞癌,是一种严重危害人类健康的病原体。目前,抗HBV感染的治疗效果远不能令人满意,其重要原因之一就是不能快速有效地抑制HBV的复制表达和清除病毒。 HBV在感染肝细胞胞核内持续复制,难以被抗病毒药物彻底清除。HBV在肝细胞中强大的复制能力说明病毒拥有一套严密精确的自我调控机制,使病毒持续复制增殖,在体内建立持久的感染。因此,寻找HBV复制、转录过程中起关键作用的调控元件,不仅有利于深入了解病毒的分子生物学特性,而且对于开发研制针对新的抗HBV靶位的药物也具有重要意义。 作为调控元件的一段DNA序列,可与某些细胞蛋白或病毒蛋白结合,正性或负性在转录或转录后水平调节基因的表达。目前,人们对于HBV负链转录调控的研究已较透彻,而对HBV正链(即反义链)的转录及调节却知之甚少。目前的研究结果表明,HBV正链产生的转录体(antisense RNA,asRNA)在细胞系或体内含量很低,对病毒的复制及表达起负性调节作用,而HBV在演变过程中也采取了一些“策略”抑制由正链转录的asRNA的产生,例如通过HBV正链上的负性调节元件下调正链的转录。 本课题主要利用荧光素酶检测体系,通过PCR扫描,缺失突变和实时定量PCR等方法,对HBV正链基因组进行全面的解析,力图发现在HBV正链转录调控中起重要作用的新的调控元件,特别是抑制性元件,并对其进行较为精确的定位,分析其作用方式及机理,为深入理解HBV复制表达的自身调控提供新的知识,为抗HBV感染的治疗提供新的思路。研究结果表明,HBV正链nt509-1(3182)-2639序列在肝源性细胞(HepG2)中能下调荧光素酶(luciferase)活性,降低luciferase mRNA水平,由此推测,HBV正链nt509-1(3182)-2639序列中含有负性调节元件,能抑制目的基因的转录。通过一系列的缺失突变分析,负性调节元件的范围被确定为HBV正链nt453-250序列。对这一负性调节元件作用方式的研究结果表明,负性调节作用是不依赖于其插入方向及插入位点的,不管是以luciferase还是增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,当这段序列以nt453-250或者nt250-453的方向分别插入目的基因启动子的上游或者polyA之后时,均观察到对目的基因的转录表现出明显的抑制作用。而不同的启动子(SV40,CMV)也不影响HBV nt453-250序列负性调节作用的发挥。对负性调节元件嗜肝性的研究结果表明,HBV nt453-250序列在非肝源性细胞A549(肺癌细胞系)和Hela(宫颈癌细胞系)中也能下调目的基因的表达,因此,这种负性调节作用无肝脏特异性,与HBV的嗜肝性无关。对负性调节元件转录调控机制的研究结果表明,HBV nt453-250序列对转录的抑制作用发生在转录起始阶段,而非延伸阶段或者转录后水平。定点突变的研究结果表明,HBV nt453-250序列由三个亚元件组成,分别为HBVnt453-434,HBVnt403-384,HBVnt283-264片段,以协同的方式发挥抑制作用。同源性分析的结果表明,HBV nt453-250负性调节元件及三个亚元件在HBV各基因型和嗜肝DNA病毒科的其他病毒(WHV, DHBV)中均有较高的同源性。 本课题的研究结果表明HBV nt453-250序列是HBV正链上一个新的负性调节元件,至今未见国内外相关研究报道。HBV正链上的负性调节元件,通过下调HBV asRNA的表达,促进HBV以负链为模板转录,保护负链的转录产物作为逆转录及翻译相应病毒蛋白的模板,对HBV的复制和表达起到正向调节的作用。HBV通过正链的负性调节元件,自我调节其自身的复制和表达。因此,HBV正链负性调节元件的鉴定及功能分析,不仅深化了对HBV分子病毒学机制的认识,而且其本身作为HBV全基因组序列的一部分,有可能作为抗HBV基因治疗的新的靶位,研究其作用方式,可为今后的抗病毒治疗提供新的思路。