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《重庆医科大学》 2007年
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早期自然流产蜕膜组织基因表达谱和蛋白质组研究

余秋波  
【摘要】: 正常蜕膜组织是母-胎界面间一个非常复杂而又高度协调的微环境,它由多种细胞如侵袭至蜕膜的绒毛外滋养细胞(extravi11ous trophoblast,EVT)、子宫内膜源性细胞(如上皮细胞和血管内皮细胞)、骨髓源性细胞(如大颗粒淋巴细胞、蜕膜巨噬细胞、T细胞和少许B细胞)构成,这些细胞以及由这些细胞、母体和胎儿所分泌到蜕膜的细胞因子共同形成了母-胎间信息交流的平台,并对胚胎滋养细胞“有控性”侵袭、子宫内膜的免疫容受性、蜕膜化和胎盘的形成进行精细的调控。一旦蜕膜组织的这种精细调控失去平衡,如某些基因的表达变化或某种细胞因子发生变化(如基质金属蛋白酶MMPs与其抑制剂TIMPs表达失去平衡),蜕膜组织微环境的精细调控就会被打破,母体就会对胎儿产生排斥反应,导致胚胎流产。 早期自然流产是指在娠妊12周之前非故意终止的宫内妊娠,是临床常见的病理妊娠之一,其发生率占全部自然流产的62%以上。在这些流产病例中,相当一部分的流产动病因不明。近年来,随着子宫内膜容受性、蜕膜组织病理学研究表明,胚胎滋养细胞有控性侵袭子宫内膜是胚胎正常发育的基础,而这种机制的形成正是以子宫内膜正常蜕膜化为前提。而早期自然流产的蜕膜组织,其蜕膜微环境发生了哪些变化?这些变化与自然流产的内在联系如何?以往人们一直试图从蜕膜组织中某一特定的基因或蛋白作为突破口,探寻其与自然流产发生的关系,但多是从单一基因或单一蛋白分子的角度去研究,而从基因表达谱或蛋白质组学整体水平变化上去探寻自然流产的病因尚未见报道。目前,大规模的基因表达谱和蛋白质组学分析技术已广泛应用于生命科学研究领域,其中寡核苷酸芯片、DNA微阵列以及基因表达系列分析是应用最为广泛和最有效的基因表达分析技术。目前已有的人类全基因组芯片U133 plus2.0,包含了39000个转录本,代表了33000个人类明晰的基因,由A和B两张芯片组成,包括100多万个探针矩阵,序列来源于GenBank,dbEST,refseq数据库。利用U133 plus2.0芯片,可以高通量地对自然流产蜕膜的基因表达变化进行分析。而二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis)和质谱(mass spectrometry)技术,主要用于研究基因转录后蛋白质的表达水平、氨基酸序列和修饰方式等。因此,我们借助于基因芯片和蛋白质组学研究技术,分析了自然流产蜕膜组织的基因表达变化和基因转录后蛋白质的表达变化,获得了自然流产蜕膜组织细胞的基因表达谱和蛋白表达谱,为探索自然流产的分子基础和可能的发生机制以及自然流产的病因诊断、预防和治疗奠定了重要的实验基础。 通过人类全基因组芯片U133 plus2.0分析,我们观察到了自然流产蜕膜组织中1876个基因表达的变化,其中基因表达上调的1004个,下调的872个。对1876个差异表达基因进行生物学功能检索发现:细胞外基质相关基因上调37个、下调32个;信号转导相关基因上调83个、下调47个;转录调节相关基因上调71个、下调59个;细胞生长/维持相关基因上调85个、下调88个;代谢相关基因上调103个、下调86个;凋亡相关基因上调55个、下调27个;物质转运相关基因上调67个、下调77个;细胞周期相关基因上调21个、下调23个;应激反应相关基因上调9个、下调3个;细胞防御反应相关基因上调28个、下调7个;免疫应答相关基因上调41个、下调25个;细胞黏附相关基因上调31个、下调47个;发育相关基因上调81个、下调85个。此外,通过检索,我们发现有558个基因尚无功能描述,其中上调293个、下调265个。对1318个已知功能基因进行了Pathway分析,发现主要涉及MAPK、ERK、P38、Jak-STAT、Natural killer cell mediated cytotoxicity、mTOR、Apoptosis等信号通路。经过对基因芯片结果进行生物信息学综合分析,我们认为自然流产蜕膜组织涉及多基因网络调控,其中细胞凋亡、免疫应答、水解酶等相关基因表达上调,以及细胞粘附相关基因表达下调可能是导致自然流产的主要因素。 2-DE图谱显示,自然流产蜕膜组织蛋白质分子量(Mw)主要集中在14-116 KDa范围内,等电点(pI)主要分布在pH 4.0-8.0之间。PDQuest软件分析2-DE图像,得到正常蜕膜和自然流产蜕膜组织蛋白点分别为613个和583个。以正常蜕膜为参照,自然流产蜕膜的蛋白点与其匹配率为78%,表达差异的蛋白点有73个(上调38个,下调35个),其中蛋白表达上调3倍以上的蛋白点有23个,下调3倍以上的点有17个;仅在自然流产蜕膜中表达的蛋白点有22个,仅在正常蜕膜中表达的蛋白点有19个。对15个差异显著的蛋白点进行MALDI-TOF-MS鉴定,经数据库查询,9个蛋白点获得了有意义的结果(p0.05):1,2号均为波形蛋白Vimentin,4号为钙网织蛋白前体(Calreticulin precursor,CRP55),7号为膜联蛋白A5(Annexin A5),8号为原肌球蛋白-4(Tropomyosin alpha-4);11号为Endoplasmin precursor(glucose regulated protein Grp94),12号为蛋白质二硫键异构酶A3前体(Protein disulfide-isomerase A3 precursor),14号为膜联蛋白A1 (Phospholipase A2 inhibitory protein,Annexin A1),15号为α-烯醇化酶(α-enolase)。其中1、2、7、14、15号蛋白表达增加,8、11、12蛋白表达下降,4号蛋白仅在自然流产的蜕膜组织中表达。通过质谱技术鉴定出的这些差异蛋白质,其功能涉及绒毛外滋养细胞侵袭、自然流产蜕膜组织血管的重建及蜕膜细胞的凋亡等。 我们对基因芯片中高表达(Signal Log Ratio=5.5)的基质金属蛋白酶10 (MMP10)进行了初步的功能学研究。结果发现MMP10在自然流产蜕膜基质细胞中表达较高,而在正常蜕膜组织中表达较低,在细胞核已经发生浓缩裂解的流产蜕膜组织细胞中,其胞浆为阴性,在Transwll实验中MMP10还能促进绒毛外滋养细胞(HPT-8)的侵袭。MMP10的这些特点,提示其在自然流产蜕膜中的高表达可能是代偿性的,因在正常妊娠的早期胚胎滋养细胞侵袭蜕膜过程中,水解细胞外基质主要依赖胚胎滋养细胞自身分泌的基质金属蛋白酶MMP2、MMP9等,而MMP10并不发挥重要作用,我们在流产蜕膜组织中观察到MMP10高表达,可能MMP10表达的这一变化有利于蜕膜细胞外基质的降解和重塑,为胚胎滋养细胞的侵袭提供适宜的空间,这对于阻止流产是有益的,但其确切分子机制尚有待进一步实验研究。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R714.21

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