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《重庆医科大学》 2007年
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抗CP4-EPSPS单克隆抗体的制备和生物学特性的研究

敬凌霞  
【摘要】: 目的:随着各种各样转基因食品通过贸易大量进入国际市场,转基因食品的安全性受到人们日益关注,世界各国对转基因食品的安全性存在着较大的争议,欧盟、日本等地区已经制定了相关法规对转基因食品进行了严格的管理。以孟山都(Monsato)公司的专利基因-CP4 EPSPS基因使用最为广泛,目前已广泛用于玉米、大豆、棉花等农作物。CP4 EPSPS基因来源于土壤农杆菌株系(Agrobacteriumsp)CP4株系,CP4 EPSPS基因编码CP4 EPSP合成酶,该酶对除草剂草甘膦有高抗性。本研究拟通过制备抗CP4-EPSPS蛋白的单克隆抗体,对抗体生物学特性进行鉴定,为国产EPSPS胶体金试纸条的研究创造条件,为建立快速特异检测转基因植物(GMO)的实验方法提供的工具。 方法:诱导表达含转基因大豆CP4-EPSPS基因的原核表达重组载体pQE30/CP4-EPSPS、pET32a(+)/CP4-EPSPS,并且采用了Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化CP4-EPSPS蛋白,以SDS-PAGE进行初步鉴定,并以胶体金试纸条鉴定其免疫活性。以重组蛋白CP4-EPSPS免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗CP4-EPSPS的McAb,采用间接ELISA方法和Western blot进行McAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定McAb的Ig亚类、效价及相对亲和力,并进行McAb抗原结合表位分析;并对杂交瘤细胞的染色体进行分析。 结果:重组蛋白CP4-EPSPS主要以包涵体表达,上清表达量极低,但胶体金试纸条检测发现上清中CP4-EPSPS蛋白抗原活性强,复性包涵体中CP4-EPSPS蛋白的抗原性远低于上清中CP4-EPSPS蛋白的抗原性。采用扩大培养量、缩小超声破碎重悬体积的方法,从上清中纯化CP4-EPSPS蛋白获得成功。 通过杂交瘤技术成功获得两株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞Ⅲ5A3,Ⅲ13A2。其抗体亚类均为IgG1;腹水效价分别为1:106和1:108;相对亲和力Ⅲ5A3在105以上,Ⅲ13A2在106以上。ELISA相加实验结果显示两株McAb识别相同或相近的抗原表位。Western bolt检测证明两株杂交瘤细胞所分泌的McAb特异性良好。 结论:成功地制备出抗CP4-EPSPS的两株McAb,为建立快速特异检测转基因植物(GMO)的实验方法提供了有力的工具。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q789

【引证文献】
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【同被引文献】
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