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《重庆医科大学》 2007年
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mdr1基因介导的骨髓移植在小鼠的安全性研究

王江波  
【摘要】: 目的:恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的疾病之一。尽管人类在肿瘤治疗方面有了较大的进步,综合治疗的完善,新的治疗手段不断出现,但儿童恶性肿瘤总体长期存活率仅60~70%。化疗在杀死肿瘤细胞和防止肿瘤复发和转移方面仍起着不可替代的作用。但是化疗过程中存在的两大障碍严重影响了化疗的疗效,即(1)肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性,其对化疗药物的不敏感而导致化疗失败;(2)化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时造成严重的骨髓抑制,由于病人不能耐受导致化疗方案不能实施而失败。目前已经证明造成肿瘤产生耐药的原因主要与多药耐药基因(multidrug resistance gene 1,mdr1)有关。肿瘤细胞由于高表达mdr1基因使其对化疗药物不敏感而不能被有效杀灭;骨髓细胞表达mdr1基因较低而对化疗药物异常敏感,极易被化疗药物损伤。本研究用含人mdr1全长cDNA逆转录病毒载体转染Balb/C小鼠骨髓单个核细胞,将外源性mdr1基因导入小鼠骨髓单个核细胞检测转染后mdr1基因在靶细胞的表达情况,并建立小鼠骨髓移植模型观察转染mdr1基因的造血细胞在移植到受体小鼠后对造血恢复的影响以及移植的造血细胞自身在小鼠体内的变化,以便了解逆转录病毒介导的mdr1基因转染造血干细胞在移植后对受体小鼠血液系统方面的安全性影响。 方法:对携带人mdr1全长cDNA的逆转录病毒包装细胞PA317-HaMDR1/A用秋水仙碱(120ng/ml)进行筛选;收集病毒上清液并采用病毒上清转染法转染小鼠骨髓造血细胞;采用PCR方法、免疫组化染色法分别从基因、蛋白质水平检测mdr1基因在骨髓单个核细胞中的表达情况;骨髓预处理上应用1.5 Gy、3.0 Gy、6.0 Gy三种不同剂量的60Co-γ射线照射,观察不同组小鼠造血恢复的变化情况;观察移植了转染有mdr1基因的造血细胞的Balb/c小鼠造血恢复情况,并应用免疫组化与RT-PCR法检测骨髓单个核细胞中mdr1基因的表达情况,同时检测骨髓单个核细胞部分重要增殖凋亡因子(bcl-2、Bax、Ki-67、p53、PCNA)的表达。 结果:(1)经秋水仙碱筛选后,培养的包装细胞PA317-HaMDR1/A上清液病毒滴度提高了1.49倍(1.71×106(CFU/ml)/1.15×106(CFU/ml)),经离心浓缩后病毒滴度提高2.12倍(3.63×106(CFU/ml)/1.71×106(CFU/ml));(2)RT-PCR法证实外源性mdr1基因可有效地整合到小鼠骨髓单个核细胞基因组中并进行转录表达;(3)免疫组化法测得体外转染细胞P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达的阳性率为22.40%;(4)60Co-γ射线照射后6.0Gy组小鼠在9天内全部死亡;在第3天1.5Gy组、3.0 Gy组小鼠骨髓腾空后的骨髓细胞最低量可以降低到正常小鼠体内的数量的42.1%、26.7%,而1.5Gy组、3.0 Gy组小鼠第9天时骨髓细胞数量分别增殖为最低时的3.9倍、2.5倍;(5)移植未转染造血细胞组与移植转染mdr1基因造血细胞组小鼠外周血白细胞计数在1个月时没有明显差异(P0.05),均恢复到正常小鼠外周血白细胞水平,至移植2月后,前者外周血白细胞平均计数为7.42×109/L,后者为9.06×109/L,统计学分析显示两者存在明显差异(P0.05);(6)移植了转染有mdr1基因的造血细胞的受体小鼠1个月与2个月时骨髓P-gp表达平均阳性率为7.93%与6.54%;(7)移植转染mdr1基因单个核细胞组小鼠骨髓单个核细胞的增殖因子Bcl-2、Ki-67、PCNA与空白对照小鼠的因子表达没有明显差异(P值0.05);凋亡因子中p53表达没有明显差异,但Bax因子表达明显降低(P0.01),致使Bcl-2/Bax比值相对于空白对照小鼠组显著升高。 结论:通过逆转录病毒载体可在体外将外源性mdr1基因转入小鼠骨髓单个核细胞中,转染的mdr1基因能整合到骨髓单个核细胞基因组中并有功能性表达;mdr1基因转入小鼠骨髓单个核细胞在移植后短期内对受体造血细胞没有显著影响,但从长期看来(本研究观察2个月)转染了mdr1基因的造血干细胞的凋亡因子Bax表达降低,更有利于受体鼠造血的恢复;另一个方面它也同时提出一个问题,即mdr1基因转染造血干细胞在回输受体后造血过程的增殖凋亡平衡。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R730.5

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