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《重庆医科大学》 2007年
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小鼠胚胎植入不同时期子宫内膜蛋白质组研究

赖雪梅  
【摘要】: 目的: 胚胎侵入子宫内膜的过程称为着床或植入(implantation)。胚胎植入是一个复杂且精细的过程,涉及胚胎在子宫内膜的粘附、侵入、发育分化以及子宫内膜的同步化改变。胚胎发育到特定时期,子宫内膜必须发生一系列复杂的变化,并且达到可容受状态,胚胎才能成功的植入,但至今对其机制尚不十分清楚。目前研究多仅限于单个蛋白质,不能解释其整个复杂过程。本研究利用蛋白质组的相关技术分析小鼠胚胎植入不同时期子宫内膜的蛋白质差异,有助于从蛋白质组整体水平上探讨胚胎植入的分子机制。 方法: 1、建立NIH小鼠妊娠动物模型,分离妊娠d3、d5、d7小鼠子宫内膜组织,分别于-80℃冻存。 2、双向凝胶电泳(2-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)分别分离妊娠d3、d5、d7小鼠子宫内膜组织蛋白质,考马斯亮蓝染色,PDQuest软件进行图像分析。 3、对12个差异表达蛋白点用胰酶进行胶内酶切,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析酶切片断,得到肽质量指纹图(PMF),使用国际互联网上Matrix Science公司提供的PMF鉴定程序(Mascot: Peptide Mass Fingerprint)进行查询,每个查询得到一个分值(Mowse Score),根据分值计算概率来评价每个检索结果是否有意义。通常可接受的域值是:一个事件随机发生的概率小于5%,则该事件为有意义(p0.05)。 4、收集孕d3、d5、d7小鼠子宫内膜,采用RT-PCR、Western blotting技术测定Annexin A1 mRNA和Annexin A1的表达水平,并利用免疫组织化学法和原位杂交法分别定性检测Annexin A1和Annexin A1 mRNA在小鼠子宫内膜的分布情况,并对其作半定量分析。 结果 1、2-DE图谱显示,小鼠子宫内膜组织蛋白质分子量(Mw)主要集中在14.4~116 kDa范围内,等电点(pI)主要分布在pH 4.0~8.0之间。比较孕3d、5d、7d不同时期子宫内膜蛋白质考染图谱(PDQuest7.3软件分析图像),结果显示孕d3、d5、d7子宫内膜蛋白质表达图谱大体一致,其蛋白点分别为713个(d3)、736个(d5)、673个(d7)。以孕d5子宫内膜2-DE图谱为参考,孕d3、d7的2-DE图谱与其匹配率分别为68%、61%。3倍以上差异表达蛋白总数为105个:与孕d3子宫内膜相比,孕d5表达上调3倍以上的蛋白点有24个,表达下调3倍以上的蛋白点有7个;与孕d7子宫内膜相比,孕d5表达上调3倍以上的蛋白点有32个,表达下调3倍以上的蛋白点有19个;与孕d7子宫内膜相比,孕d3表达上调3倍以上的蛋白点有15个,表达下调3倍以上的蛋白点有8个。 2、对12个差异候选蛋白点进行MALDI-TOF-MS鉴定,经数据库查询,5个蛋白点获得了有意义的结果(p0.05),分别为载脂蛋白A-I(Apo-AI)、膜联蛋白A1(Annexin A1)、谷光甘肽转移酶(Glutathionetransferase omega-1,GSTO1-1)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor A3M)、烯醇化酶( Alpha-enolase)。 3、RT-PCR、原位杂交、Western blotting和免疫组织化学方法分析均显示Annexin A1基因表达和蛋白表达在孕d3较强、孕d5最强、孕d7最弱,其主要分布在妊娠小鼠子宫内膜的腺上皮和腔上皮。 结论 1、Apo-AI在胚胎植入前期即可被检测到,并一直持续到植入后期,提示Apo-AI对小鼠胚胎植入具有促进作用;Annexin A1在d3和d5子宫内膜组织中的表达明显高于d7,提示该蛋白可能通过对细胞凋亡、炎症反应等多个途径的调节促使子宫内膜达到容受状态而促进胚胎植入;GSTO1-1可能通过对子宫内膜局部免疫的调节而促进胚胎植入;丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M在胚胎植入前、中、后都有表达,以d5为最强,提示可能通过抑制蛋白酶的活性,防止基质被过度降解,从而参与胚胎植入的调控;烯醇化酶在孕d3表达最高,提示该蛋白可能参与了纤溶酶对细胞外基质的降解,为滋养层细胞的浸润做好准备。 2、Annexin A1在胚胎植入不同时期的小鼠子宫内膜腺上皮、腔上皮均有表达,且具有极强的时段性,以孕d5(植入窗口期)表达最强。由此推测Annexin A1可能参与了植入初期胚胎对子宫内膜的粘附以及与胚胎滋养细胞侵袭相关的蜕膜化改变。 3、本研究结果显示,在小鼠胚胎围着床期子宫内膜组织差异表达的蛋白质多为参与机体免疫反应和子宫基质降解的蛋白分子,这些蛋白分子在调节子宫内膜达到最佳容受状态和促进胚胎植入中起着非常重要的作用。其中,Annexin A1在小鼠子宫内膜表达的高峰与小鼠胚胎植入时间高度一致,提示了Annexin A1与胚胎植入密切相关。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q813

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