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《重庆医科大学》 2008年
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幽门螺杆菌重组HpaA蛋白的表达及其包涵体纯化方法的探讨

栗俊杰  
【摘要】: 研究目的:用基因工程技术克隆和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的hpaA基因,以期获得重组蛋白HpaA,并鉴定其抗原性和免疫原性,为进一步制备预防H.pylori感染的HpaA制剂提供了材料。采用镍柱层析和切胶纯化两种方法提取可溶性rHpaA,并比较其效果,为hpaA表达中的包涵体纯化提供一条经济便捷的方法。 方法:用PCR方法从H.pylori DNA中扩增hpaA基因片段。插入原核表达载体pQE30,转化受体菌DH5α,经克隆及序列分析正确后在大肠杆菌中进行表达。SDS-PAGE分析表达蛋白的分子量和表达形式,经镍柱层析纯化后Western blot证实其抗原性;免疫小鼠后ELISA检测血清特异性抗体鉴定其免疫原性。将SDS-PAGE电泳后的表达蛋白用4M的乙酸钠显色指示切胶,所切胶块在透析袋中经电场作用,提取可溶性目的蛋白,Western blot鉴定其抗原性;同时以间接ELISA法比较分别以切胶纯化法和镍柱层析法所得表达蛋白与抗体结合的滴度。 结果:重组表达质粒pQE30-hpaA构建成功,插入的基因片段全长782bp,与基因文库中的hpaA基因同源性达97.0%。SDS-PAGE显示表达产物相对分子量为30kD,表达量占全菌总量的32.3%,主要以包涵体形式表达,具有良好的抗原性和免疫原性,镍柱层析纯化后纯度达97%。重组蛋白包涵体经切胶纯化后可得到纯度93.9%的可溶性重组HpaA,Western blot鉴定切胶纯化法提取的可溶性rHpaA也具有良好的抗原性,经ELISA法比较,其抗体结合滴度与镍柱层析法提取的rHpaA相近。 结论:H.pylori hpaA基因片段克隆表达成功,获得高纯度可溶性的重组HpaA蛋白,具有良好的抗原性和免疫原性,为进一步制备预防H.pylori感染的HpaA制剂提供了材料。并证实了切胶纯化包涵体蛋白的方法切实可行,与传统方法比较,简单经济实用,为大量制备可溶性HpaA提供了新的方法。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R378.2

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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9 赵洁;刘楚吾;;笛鲷AFLP分析体系的确立[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会(第三卷)[C];2010年
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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7 池小琴;酿酒酵母海藻糖代谢工程与抗逆性相关机制研究[D];浙江大学;2010年
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9 梁东;苹果山梨醇代谢相关基因的分子特性研究[D];西北农林科技大学;2010年
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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3 黄潘;鸡胚性分化早期性别差异表达miRNAs的鉴定及其特性分析[D];华中农业大学;2010年
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5 曹晶;风疹病毒(RV)包膜糖蛋白E1特异基因片段的原核表达[D];南京医科大学;2009年
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【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
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【相似文献】
中国期刊全文数据库 前3条
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1 王艳艳;溶栓新药瑞替普酶(Reteplase)变复性及分离纯化的研究[D];山东大学;2006年
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3 刘敬卫;茶树多酚氧化酶的基因克隆与原核表达[D];华中农业大学;2009年
4 李刚;人重组IL-22蛋白的表达及其生物学特性的初步分析[D];苏州大学;2009年
5 李文雯;乳糖诱导家蚕抗菌肽融合蛋白的表达[D];西北农林科技大学;2010年
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