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《重庆医科大学》 2008年
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加味三棱丸对子宫内膜异位症雌激素生成的影响及机制研究

李傲  
【摘要】: 背景 子宫内膜异位症(以下简称内异症)是生育年龄妇女的常见良性疾病。它可浸润病灶周围的正常组织,治疗后易于复发,具有一定的“恶性”行为。近年来发病率有逐年升高趋势,成为妇科疾病中的热点问题。尽管EMS的发病机制仍未阐清,但在经血逆流“种植学说”的基础上,越来越多的资料表明,EMS患者的在位内膜存在与异位内膜相似而与正常内膜迥异的遗传和功能特性。因此我们推测,在位内膜是EMS病变的源头,而直接干预在位内膜可达到防治EMS的效果。 内异症是一种雌激素依赖性疾病,雌激素的合成代谢在内异症疾病的发生、发展中占有重要的地位。既往研究提示,加味三棱丸有效成分(以下简称SLW)具有良好的抗子宫内膜异位症作用。因此,以“EMS是雌激素依赖性疾病”为切入点,探讨SLW源头治疗内异症的作用靶点及机制,可为其早日成为新的内异症治疗药物提供基础研究依据。 目的 观察SLW对内异症在位内膜雌二醇生成水平的影响,及其对参与雌二醇生成过程中恶性正反馈循环的关键酶及转录因子的影响;观察SLW对大鼠异位子宫内膜的发展、雌二醇生成、粘附及抗凋亡能力的影响,并进一步探讨SLW抑制内异症内膜细胞中雌二醇的生成在其抗子宫内膜异位症中的关键作用机制。 方法 1.培养内异症和非内异位症在位内膜(Eu and En)细胞,分为非内异症内膜细胞组、内异症内膜细胞组、SLW 170μg/ml组、17μg/ml组、1.7μg/ml组及0.1mg/kg阿那曲唑组。采用WST-8法检测SLW对Eu和En细胞增殖情况的影响,RT-PCR法和western blot检测En细胞及SLW处理后的Eu细胞中细胞色素P450芳香化酶(P450 arom)、环氧合酶-2(COX-2),类固醇类生成因子-1(SF-1)、小鸡卵清蛋白上游启动子转录因子(COUP-TF)mRNA及其蛋白的表达,17-β-羟甾类脱氢酶1,2(17-β-HSD 1,2)mRNA的表达情况;细胞免疫荧光法观察En细胞及SLW处理后的Eu细胞中SF-1和COUP-TF蛋白的表达,电化学发光免疫法和放射免疫法分别检测SLW对Eu细胞培养液上清中雌二醇(E2)和前列腺素E2(PGE2)水平的影响。 2.选择动情期大鼠行子宫内膜自体移植术,建立大鼠子宫内膜异位症疾病模型,取移植物积液高度≥2mm,病理学检查有子宫内膜组织生长的成功模型动物,分为SLW 1.02 mg/kg组、0.34 mg/kg组和0.11 mg/kg组、0.1mg/kg阿那曲唑组、模型对照组,同时设立正常对照组。用药前经统计学检验,除正常对照组外,各组异位内膜体积间无显著性差异。灌胃给药,每天1次,连续28天。检测异位内膜体积,常规HE染色,免疫组织化学法和western blot检测异位组织中P450 arom和COX-2蛋白的表达;电化学发光免疫法和放射免疫法分别观察SLW对异位内膜组织中E2和PGE2水平的影响;免疫组织化学法和TUNEL法分别检测SLW对大鼠异位子宫内膜中细胞间粘附分子(ICAM-1)蛋白表达及细胞凋亡的影响。 3.首先将内膜细胞分为非内异症内膜细胞对照组、内异症内膜细胞对照组和SLW 17μg/ml组,采用结晶紫染色法检测内膜细胞的粘附能力,明胶酶谱法分析内膜细胞分泌基质金属蛋白酶2,9(MMP-2,9)及其酶原的活性,细胞免疫荧光法观察组织型金属蛋白酶抑制剂1,2(TIMP-1,2)蛋白的表达,ELISA法检测内膜细胞培养上清中血管内皮生长因子(VEGF)的含量,流式细胞术和TUNEL法分别检测内膜细胞早期和晚期凋亡率。同时选取SLW的各测定指标最佳作用时间点,作为后续实验的检测时间点。随后,将SLW 17μg/ml与终浓度为1.34pg/ml~6.36pg/ml的雌二醇进行联合干预,并同时设计0.1μg/ml阿那曲唑组和终浓度为1.34pg/ml~6.36pg/ml的雌二醇组作为正反对照,在各检测时间点上按照上述方法对各项指标进行检测。 结果 1. WST-8法结果提示,体外培养的Eu细胞在各时相点的增殖速度,明显高于En细胞(P0.05),但SLW对Eu细胞的增殖能力没有显著的影响;SLW 170μg/ml和17μg/ml组在作用48h、72h和96h时,分泌雌二醇的水平较Eu细胞对照组明显降低,差异显著(P0.05)。而SLW 1.7μg/ml组仅在96h时显著降低内异症在位内膜细胞分泌雌二醇水平,其余各时间点与Eu细胞对照组比较,差异无显著性(P0.05)。western blot和RT-PCR结果显示,给予SLW 170μg/ml、17μg/ml和1.7μg/ml 48h后的Eu细胞,P450 arom、COX-2、SF-1蛋白和mRNA表达较Eu细胞对照组明显降低,而COUP-TF蛋白和mRNA表达显著升高(P0.05);细胞免疫荧光结果也显示,SLW 170μg/ml、17μg/ml组SF-1阳性细胞累积光密度值与Eu细胞对照组比较显著降低,而COUP-TF阳性细胞累积光密度值显著升高(P0.05),与western blot和RT-PCR半定量分析结果一致。同时,放射免疫法结果显示,SLW 170μg/ml、17μg/ml和1.7μg/ml组细胞上清中PGE2的浓度,明显低于Eu细胞对照组(P0.05)。RT-PCR结果同时显示,经SLW处理后, Eu细胞中HSD-1 mRNA表达显著减少,而HSD-2 mRNA表达明显升高,与Eu细胞对照组比较差异显著(P0.05)。 2.造模28天后,腹壁移植物体积增大,出现液体积聚,呈隆起透明的小囊状,被结缔组织或大网膜覆盖并有血管形成。以抑制物积液高度≥2mm,病理学检查有子宫内膜组织生长为模型成功标准,42只大鼠中40只符合上述标准,造模成功率为95.24%。SLW 1.02 mg/kg组、0.34 mg/kg组和0.11 mg/kg组的移植物体积与模型对照组相比明显减小,差异显著(P0.05)。HE染色光镜下观察模型对照组异位内膜腺上皮细胞呈高柱状或矮柱状,排列在囊泡内腔面,细胞间连接较紧密,细胞核大,呈椭圆形,位于基底部,胞浆丰富,内膜间质丰富,其中有个别部位上皮层内陷形成假腺体;SLW 1.02 mg/kg组、0.34 mg/kg组和0.11 mg/kg组和0.1mg/kg阿那曲唑组的内膜腺上皮层明显变薄,细胞呈矮柱状甚至扁平状,松散排列。 免疫组织化学和western blot结果显示,SLW 1.02 mg/kg组、0.34 mg/kg组和0.11 mg/kg组异位内膜组织中P450 arom蛋白的表达值与模型对照组比较,显著降低(P0.05);SLW 1.02 mg/kg组可以显著降低模型大鼠异位内膜组织中COX-2蛋白的表达(P0.05),SLW 0.34 mg/kg组和0.11 mg/kg组虽有一定的降低趋势,但无统计学差异(P0.05)。同时,电化学发光免疫法和放射免疫法结果也显示,SLW 1.02 mg/kg组、0.34 mg/kg组和0.11 mg/kg组异位内膜组织中E2和PGE2的浓度,也明显低于模型对照组(P0.05)。 免疫组织化学结果显示,模型对照组异位组织ICAM-1阳性染色细胞数量多而密集,染色呈淡黄色或棕黄色;SLW 1.02 mg/kg组、0.34 mg/kg组和0.11 mg/kg剂量组阳性细胞数量少,浅染,阳性程度和面积评分与模型对照组比较有显著性差异(P0.05)。SLW 1.02 mg/kg组、0.34 mg/kg组的阳性细胞累积光密度值也显著低于模型对照组(P0.05)。TUNEL法结果显示,SLW 1.02 mg/kg组、0.34 mg/kg组和0.11 mg/kg组内阳性细胞数显著增加,细胞凋亡指数增加,与模型对照组比较,差异显著(P0.05)。 3.将SLW 17μg/ml与Eu细胞共同孵育24h后,ELISA法检测结果显示,Eu细胞培养液上清中VEGF的含量显著高于En细胞组(P0.05);结晶紫染色法、明胶酶谱法和细胞免疫荧光结果分别显示,48h后Eu细胞的粘附百分数,MMP-2,9及其酶原的活性显著高于En细胞,而TIMP-1,2蛋白的表达明显低于En细胞组(P0.05);流式细胞术和TUNEL法结果分别显示,72h后的Eu细胞早期凋亡百分数显著低于En细胞组,96h后Eu细胞晚期凋亡指数也显著低于En细胞组(P0.05);同时,SLW 17μg/ml可同时降低Eu细胞分泌的VEGF含量、细胞粘附百分数、MMP-2,9及其酶原的活性,上调TIMP-1,2蛋白的表达,增加Eu细胞早期和晚期凋亡数目,与Eu细胞对照组比较,差异显著(P0.05)。当SLW 17μg/ml与雌二醇1.34pg/ml~6.36pg/ml联合给予时,Eu细胞被SLW改善的恶性生物学行为被反向添加的雌二醇部分或完全恢复。其中,Eu细胞的粘附百分率、MMP-2和pro-MMP-9活力、TIMP-1,2蛋白的表达以及Eu细胞培养液上清中VEGF的含量与与Eu细胞对照组比较,已无显著性差异(P0.05)。单加雌二醇可进一步加强Eu细胞的粘附、侵袭、促血管生成及抗凋亡能力,而特异性的芳香化酶抑制剂阿那曲唑0.01μg/ml的作用恰与雌二醇相反。 结论 1. SLW体外可抑制内异症在位内膜细胞雌二醇的生成,这种抑制作用非依赖于抑制Eu细胞的增殖,而与抑制Eu细胞SF-1表达,促进COUP-TF表达,特异性地抑制Eu细胞中P450 arom的表达,进而降低P450 arom对COX-2的激活作用,并降低Eu细胞分泌PGE2的水平,从而阻断内异症内膜局部雌激素合成的正反馈机制密切有关。此外,SLW体外抑制Eu细胞HSD-1 mRNA表达、促进HSD-2 mRNA表达的作用可能也是其降低Eu细胞雌二醇生成机制之一。 2. SLW可抑制大鼠子宫内膜异位症的发展,缩小异位内膜体积,改善异位内膜组织病理学变化,降低异位内膜组织中雌二醇含量,其机制与SLW特异性地抑制异位内膜组织中P450 arom蛋白,降低P450 arom对COX-2的激活作用,进而抑制E2和PGE2的生成,阻断雌激素生成的正反馈环有关。 3. SLW可抑制大鼠异位子宫内膜细胞的粘附能力,促进异位内膜细胞凋亡,其机制与SLW抑制大鼠异位内膜组织ICAM-1表达,激活异位内膜细胞中内源性核酸内切酶有关。 4. Eu细胞在体外与En细胞比较,粘附腹膜、侵袭腹膜基底膜、促血管生成及抗自身凋亡的能力更强,Eu细胞的上述特质受其局部雌二醇浓度的影响。SLW可抑制Eu细胞粘附、侵袭、促血管生成,促进Eu细胞凋亡,其机制与SLW抑制Eu细胞与Ⅰ型胶原的特异性粘附,降低MMP-2,9活力,提高TIMP-1,2表达,降低Eu细胞VEGF的分泌,促进其胞膜内层磷脂酰丝氨酸外翻,激活细胞中内源性核酸内切酶有关。降低Eu细胞局部雌二醇合成是SLW治疗内异症的关键,它与上述作用机制密切相关。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R271.9

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中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 向东方;孙巧璋;梁雪芳;;腹针治疗子宫内膜异位症盆腔疼痛的疗效观察[A];2011中国针灸学会年会论文集(摘要)[C];2011年
2 李筱梅;;腹壁子宫内膜异位症的彩色多普勒超声诊断[A];中国超声医学工程学会第八届全国腹部超声学术会议论文汇编[C];2010年
3 屈王蕾;董剑达;陈文兵;;盆腔外子宫内膜异位症8年病例临床分析[A];首届沪浙妇产科学术论坛暨2006年浙江省妇产科学学术年会论文汇编[C];2006年
4 路红;钱惠勤;;剖宫产术后腹壁切口子宫内膜异位症27例临床分析[A];2007年浙江省妇产科学围产医学联合学术年会论文汇编[C];2007年
5 陈拯民;;青春期女性如何及早发现和治疗子宫内膜异位症[A];浙江省中西医结合学会生殖医学专业委员会第八次学术年会暨国家级继续教育学习班资料汇编[C];2008年
6 邬巧霞;;腹腔镜手术联合米非司酮治疗子宫内膜异位症的临床研究[A];2011年浙江省妇产科学学术年会暨“妇产科常见疾病的临床研究新进展”学习班论文汇编[C];2011年
7 孟庆芳;曹保利;;腹腔镜联合药物治疗子宫内膜异位症伴不孕70例[A];2010全国中西医结合围绝经期专题学术会议论文集[C];2010年
8 司徒仪;冉青珍;;中药提高子宫内膜异位症模型大鼠妊娠功能的研究[A];全国第六届中西医结合妇产科学术会议论文及摘要集[C];2002年
9 马彩虹;;子宫内膜异位症合并不孕[A];全国第三届不育症暨保留生育功能微创手术研讨会论文集[C];2008年
10 聂永新;;化瘀消异汤治疗子宫内膜异位症78例[A];全国第六届中西医结合妇产科学术会议论文及摘要集[C];2002年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 士平;子宫内膜异位症不可轻视[N];中国妇女报;2000年
2 刘晓芹;恼人的子宫内膜异位症(之三)[N];中国人口报;2004年
3 舒楚强;子宫内膜异位症与不孕[N];大众卫生报;2004年
4 史建纲;如何根治子宫内膜异位症[N];甘肃日报;2003年
5 兰州现代中医药研所 史建钢;子宫内膜异位症能否根治?[N];甘肃日报;2004年
6 ;子宫内膜异位症能否不手术??[N];健康时报;2004年
7 上海交通大学附属第六人民医院中医科主任医师 霍清萍;谈谈子宫内膜异位症[N];家庭医生报;2004年
8 江苏 董卫国;活血通腑法治子宫内膜异位症[N];民族医药报;2002年
9 董卫国;活血通腑法治子宫内膜异位症[N];中国医药报;2001年
10 吴凡;张海峰;陈思亮;异位散治疗子宫内膜异位症[N];中国医药报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 林素芬;子宫内膜异位症近20年中医临床文献研究[D];广州中医药大学;2013年
2 江秀秀;水通道蛋白在子宫内膜异位症的表达及子宫内膜细胞迁徙中的作用[D];浙江大学;2010年
3 宋楠;子宫内膜异位症疼痛与瞬时受体电位辣椒素亚型-1表达的研究[D];中国协和医科大学;2010年
4 陈琼华;脂氧素对子宫内膜异位症抑制作用的研究[D];华中科技大学;2011年
5 郭广宏;子宫内膜异位症相关生物标志研究及辅助诊断模型的建立[D];中国人民解放军军医进修学院;2013年
6 章蓉娅;子宫内膜异位症病灶组织克隆性的研究[D];北京协和医学院;2009年
7 戴玥;不同气腹介质及作用时间对子宫内膜异位症大鼠模型异位灶影响的分子机制研究[D];第二军医大学;2010年
8 宋淑芳;来曲唑治疗大鼠子宫内膜异位症模型的实验研究[D];天津医科大学;2011年
9 张硕;子宫内膜异位症合并不孕相关研究及重组人促黄体生成素对辅助生育结局的影响[D];中国人民解放军医学院;2013年
10 王宇非;丹参酮ⅡA对体外培养的子宫内膜异位症在位内膜细胞粘附作用的影响[D];黑龙江中医药大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 翟爱丽;羟基红花黄色素A对体外培养子宫内膜异位症在位内膜细胞增殖及细胞因子表达的影响[D];河北医科大学;2010年
2 李艳;痛可舒治疗子宫内膜异位症的临床观察[D];黑龙江中医药大学;2010年
3 史梅莹;葫芦巴丸加减治疗子宫内膜异位症腺肌病痛经及盆腔痛临床研究[D];北京中医药大学;2010年
4 李绪丽;三萜皂苷对大鼠子宫内膜异位症抑制作用的实验研究[D];河北医科大学;2011年
5 李巧时;卵巢型子宫内膜异位症保守手术治疗后复发的临床分析[D];大连医科大学;2010年
6 余峥;姜黄素抑制子宫内膜异位症雌激素生成的实验研究[D];湖北中医药大学;2010年
7 杨洋;89例特殊部位子宫内膜异位症的临床分析[D];吉林大学;2010年
8 兰丽芳;35例腹壁子宫内膜异位症临床分析[D];广西医科大学;2011年
9 张宗敏;卵巢子宫内膜异位症复发因素分析及内异停方预防其复发的临床研究[D];南京中医药大学;2010年
10 田滢舟;补肾活血方修复在位内膜缺陷治疗子宫内膜异位症不孕的临床研究[D];广州中医药大学;2011年
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