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《重庆医科大学》 2009年
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腺病毒介导GRIM19诱导人胶质瘤细胞分化及相关机制的实验研究

姚声涛  
【摘要】: 背景与目的 胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤。尽管近年来在手术、放疗、化疗等方面已取得很大进展,但其疗效仍不容乐观。目前胶质瘤的诊断、治疗取得了一定进展,根本上未改变这一致命肿瘤的自然转归,因而探索新的治疗方法显得十分迫切和必要。随着分子生物学、免疫学、细胞生物学的快速发展,生物治疗新的治疗方法包括基因治疗、诱导分化治疗为恶性胶质瘤治疗带来了希望。 信号转导调控的失控常会导致肿瘤的发生。其中作为转录因子的信号转导和转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)的异常表达与活化pSTAT3常常见于各种胶质瘤。异常活化的STAT3分子对维持胶质瘤的恶性进展是必要的,可以促进许多抗凋亡与促肿瘤细胞增殖基因的非正常转录,从而使正常细胞发生恶性转化。GRIM19(the genes-associated with retinoid–interferon induced mortality 19)是一种由维甲酸(retinoic acid,RA)与干扰素β(interferonβ,IFN-β)联合诱导的一种细胞死亡调控基因,其在许多肿瘤中具有促凋亡功能。近来发现GRIM19作为一种肿瘤抑制分子,可抑制由STAT3组成性活化诱导的细胞转化;并在胶质瘤诱导分化的过程中显著上调。在本研究中,我们构建、包装与纯化了携带人GRIM19基因的重组复制缺陷型的腺病毒,观察其介导人GRIM19基因在人恶性胶质瘤CHG-5细胞的表达对细胞表形的影响;并从细胞增殖、克隆形成、细胞粘附、侵袭及凋亡等方面研究GRIM19基因是否具有诱导CHG-5细胞的分化作用,同时探索分析其作用机制,为将来胶质瘤的治疗奠定基础。 方法 1.选择AdEasy-1 System腺病毒载体系统,利用亚克隆的方法将GRIM19基因片段从pCDNA3.1 (+)-GRIM19质粒克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV腺病毒载体。重组成功的pAdTrack-CMV-GRIM19载体转化已预先转化的pAdEasy-1腺病毒骨架质粒的BJ5183菌进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-GRIM19。 2.重组腺病毒质粒pAd-GRIM19转染人胚肾293T细胞,小量包装出重组腺病毒Ad-GRIM19,经PCR初步鉴定后反复感染293T细胞进行大量扩增,并采用氯化铯梯度离心法纯化浓缩病毒。病毒滴度采用TCID50法测定,应用GFP报告基因及有限稀释法检测对CHG-5靶细胞的感染效率。Western Blot法检测重组腺病毒Ad-GRIM19中的目的基因GRIM19的表达。同样方式包装与纯化Ad-GFP对照病毒。 3. CHG-5细胞分别经Ad-GRIM19 and Ad-GFP感染的MOI值感染后分别在24h,48h以及72h观察细胞表形的变化。台盼蓝染色检测细胞活力。CCK-8比色及软琼脂克隆形成实验检测细胞体外增殖能力的变化。Transwell小室及细胞粘附实验检测细胞外基质粘附及侵袭能力的改变. TUNEL实验及Hochest 33342染色法侦测GRIM19表达对凋亡影响。 3.免疫荧光染色检测pSTAT3, GFAP及Vimentin蛋白在CHG-5细胞中的表达状况。Real-Time PCR分别检测Bcl-2, Bax, PCNA, C-myc,CCND1,GFAP or STAT3基因的mRNA变化。2-△△CT法分析各个基因的相对表达量。Western blot法进一步分析各基因蛋白水平的变化。. DHE荧光探针染色分析活性氧ROS的变化。细胞免疫组化定性检测CD133的表达。 结果 1.酶切及测序鉴定表明重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-GRIM19亚克隆成功构建。同源重组后的腺病毒质粒pAd -GRIM19经PacⅠ酶切后可见一条4.5kb和一条约30kb的条带,表明同源重组成功。PacI线性化重组腺病毒质粒转染293T细胞进行包装,扩增的病毒上清经PCR鉴定表明扩增条带为GRIM19,证明包装成功。所将大量扩增的病毒经过纯化与浓缩后Ad-GFP与Ad-GRIM19病毒的各自滴度可分别达1.12×1010pfu/mL;与9.6×109pfu/mL。纯化的病毒能有效感染CHG-5靶细胞,Ad-GFP与Ad-GRIM19病毒对CHG-5细胞感染的MOI值分别为10与12。Western Blot结果重组腺病毒Ad-GRIM19能显著提高GRIM19在CHG-5细胞中的表达。 2. Ad-GRIM19病毒感染导致CHG-5的细胞形态显著改变。与Ad-GFP对照组比,Ad-GRIM19显著抑制CHG-5细胞的体外增殖,抑制克隆形成能力(P0.01),并能显著减弱CHG-5细胞对细胞外基质的粘附及侵袭能力(P0.01)。Tunnel及Hochest33342荧光染色表明,Ad-GRIM19组凋亡细胞数明显增加。经Real-Time PCR分析,Ad-GRIM19感染组中Bcl-2, PCNA, C-myc,CCND1及STAT3基因的mRNA水平明显下调,而Bax与GFAP表达显著上调。与Ad-GFP对照组相比,Ad-GRIM19感染组活性氧产生大量释放。 3.Western blot结果证实Bcl-2, PCNA, C-myc,CCND1及STAT3表达下调, Bax与GFAP表达显著增加与Real-Time PCR结果一致。Ad-GRIM19能显著下调STAT3磷酸化水平(p STAT3)。免疫组化结果显示, CD133阳性细胞在Ad-GRIM19组CHG-5团状细胞表面聚集。 结论 1.成功包装并纯化的GRIM19重组腺病毒能高效的感染CHG-5细胞,显著提高GRIM19在CHG-5细胞中的表达。 2.腺病毒介导的GRIM19在CHG-5细胞的表达能显著改变CHG-5细胞形态,抑制其体外增殖与克隆形成;减弱对细胞外基质的粘附及侵袭能力,增加ROS产生,诱导细胞凋亡。 3.腺病毒介导的GRIM19能明显诱导CHG-5细胞分化,这种分化可能与STAT3的活性抑制导致Bcl-2, PCNA, C-myc,CCND1及STAT3表达下调以及Bax与GFAP表达增加相关。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R739.41

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