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《重庆医科大学》 2009年
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MMP-9参与大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤病理过程的机制研究

郭宗铎  
【摘要】: 目的 检测蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)后早期大鼠海马神经元和基底动脉基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)的表达变化,观察其对海马神经元和基底动脉血管内皮细胞凋亡的影响,及与临床行为改变、血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)破坏和脑水肿的关系,探讨MMP-9参与SAH后早期脑损伤(early brain injury, EBI)的作用机制。 方法 1.构建大鼠SAH模型:通过建立三种常用SAH动物模型,比较各模型大鼠蛛网膜下腔血液含量及死亡率和病残率,选择适于本课题的SAH模型。 2. MMP-9的检测:选取不同时间点,采用RT-PCR和酶谱分析方法分别检测海马、脑基底动脉MMP-9在mRNA水平的表达及蛋白活化;采用western blot方法检测海马MMP-9总蛋白表达。 3. laminin及细胞凋亡检测:采用免疫组织化学、原位末端标记法(terminal deoxynucleotidal transferase–mediated dUTP-biotin nick endlabeling, TUNEL)检测海马、基底动脉laminin的表达及神经元和血管内皮细胞凋亡。 4.组织病理学检测:通过检测脑内伊文思蓝(Evans blue, EB)检测BBB通透性改变,并通过测定脑组织含水量(brain water content, BWC)观察脑水肿程度。 5.形态学观察:通过HE染色方法观察海马CA1区神经元形态学改变,并通过测定基底动脉管壁厚度及管腔直径,观察急性脑血管痉挛(cerebral vasospasm, CVS)。 6.行为学观察:于造模后24 h进行临床行为评估。 7.干预治疗的作用:应用MMP-9特异性抑制剂SB-3CT抑制MMP-9活性,观察其与细胞凋亡、BBB改变及脑水肿的变化关系;应用米诺环素抑制MMP-9活性,观察其对EBI的保护作用。 结果 1.视交叉前池注血模型蛛网膜下腔血液含量较其他两种模型波动小,病死率和病残率与临床发生率相近。 2. MMP-9的表达:与sham组相比,大鼠SAH后12 h海马和基底动脉MMP-9mRNA含量、蛋白表达及活性明显升高,24 h达到高峰,以后逐渐下降,但48 h、72 h仍维持在较高水平(P0.05或P0.01)。 3.免疫组化方法显示:与sham组相比,大鼠SAH后12 h海马和基底动脉laminin表达开始下降,24 h降至最低,以后逐渐升高,但48 h、72 h海马laminin表达仍维持于较低水平(P0.01)。 TUNEL检测发现:与sham组相比,大鼠SAH后12 h海马及基底动脉TUNEL阳性细胞数开始增加,24 h达到高峰,并于48 h表达开始下降, 72 h TUNEL阳性细胞数仍较高(P0.01)。 4.组织病理学检测发现:SAH后6 h组大鼠脑内EB含量及BWC与sham组相比差异无统计学意义;SAH后12 h大鼠脑内EB含量及BWC开始升高,24 h达最高,以后逐渐下降,但SAH后48 h、72 h仍维持于较高水平(P0.01)。 5. HE染色显示:SAH后12 h组海马CA1区变性神经元明显增多,与sham组相比,正常神经元密度明显降低(P0.05),24 h正常神经元密度达最低,48 h、72 h组正常神经元密度仍较低(P0.01)。同时,与sham组相比,SAH后12 h大鼠基底动脉管腔缩小,管壁增厚,24 h基底动脉痉挛最为明显,内皮细胞部分脱落,48 h基底动脉痉挛较24 h减轻,72 h基底动脉管腔直径和管壁厚度与sham组相比无明显异常。 6.行为学观察发现:各组只有少数动物出现神经功能障碍,各组之间没有发现明显统计学差异(P0.05);SB-3CT组大鼠进食及活动情况明显优于SAH组及sham组(P0.05)。 7.干预治疗显示:SAH后24 h,SB-3CT及米诺环素能够明显抑制MMP-9表达及活性(P0.01),海马TUNEL阳性神经元数量较sham组明显减少(P0.01),海马神经元形态得到改善。 结论 1.视交叉前池注血模型更好的模拟临床SAH,重复性、稳定性好,适合于SAH后EBI病理生理机制的研究。 2.大鼠SAH后MMP-9可能通过介导细胞外凋亡通路,即降解其底物laminin,导致海马神经细胞及基底动脉血管内皮细胞发生失巢凋亡这一机制,参与EBI的病理过程。 3. SB-3CT抑制SAH后MMP-9的表达及其活性,并能减轻细胞失巢凋亡,缓解脑水肿,减轻BBB通透性改变及海马CA1区神经元形态改变,具有明显的神经保护作用。 4.米诺环素显著减轻SAH后EBI,减轻神经元凋亡,其保护机制可能与米诺环素抑制MMP-9表达,阻断细胞外凋亡通路有关。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R743.35

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【参考文献】
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