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稳定表达人CYP3A4基因与Bama小型猪CYP3A基因的HepG_2细胞株的建立及探针药物代谢表征的比较研究

薛正楷  
【摘要】: 一、研究背景 人CYP3A在肝肠中表达最为丰富,约占CYP450总量的30%-40%,底物谱广,并可分成CYP3A4、CYP33A5、CYP33A7和CYP3A43四种亚型,其中CYP3A4在成年个体的肝和肠中表达最多,占肝CYPs的30%和肠CYPs的70%,参与了60%现有临床药物的代谢。 新药临床前评价过程中需要其代谢相关数据。为获得可反映人体药物代谢概貌的最佳实验动物模型,通过对不同种属动物肝微粒体的比较研究发现,狗适合作为CYP2D代谢途径的动物模型;灵长类是最合适的CYP2CN家族动物模型,而小型猪的CYP1A、CYP2A、CYP3A与人类极为相似,且该动物体型较小、易于操作和较小的底物需求量,是人类CYP3A药物评价的最佳模型动物。 目前研究认为小型猪CYP3A亚家族蛋白共有4种亚型,即CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39和CYP3A88,其中CYP3A29具有典型的硝苯地平和睾酮6β-羟基化活性(人CYP3A4和3A5的特异活性),被苯巴比妥、利福平和地塞米松诱导的活性,及对酮康唑和醋竹桃霉素抑制的敏感性。因此,除灵长类和狗以外,小型猪成为唯一被FDA推荐的临床前大动物实验动物,在药物研发、生产和监管等领域越来越多地用于狗的替代模型动物。 现有的临床前药物评价的小型猪主要有:Yucatan小型猪、德国的Gottingen小型猪、Hanford小型猪和Sinclair小型猪,特别是Gottingen在欧洲的得到了很好的推广运用;Bama小型猪产于我国的广西省,为香猪的进化品系,由于近交程度高,而且耐近交、遗传稳定、个体表型一致,在生物医药领域应用中已被证明是优秀的模型动物,并积累了丰富的解剖、生理生化、基础生物学特性及活体药物代谢背景资料,但有关其药物代谢表征的分子水平研究资料缺乏;由于重组酶成分单一,其药物代谢表征明确,被广泛用于酶表征的定性定量研究,是对酶进行特征研究的最佳工具。目前有关猪(小型猪)CYP3A亚家族同工酶的重组研究,在世界范围几乎是空白,猪(小型猪)CYP3A亚家族同工酶的药物代谢表征几乎全部都是通过人CYP3A探针药物的活体动物肝微粒体代谢特征获得,由于特异性探针药物对特定CYP450的相对性,以及猪肝微粒体成分的复杂性,其可靠性远低于重组酶。为了更好阐明Bama小型猪作为人CYP3A系统动物模型的有效性和合理性,以及各亚型在探针药物代谢中的作用特征,本研究通过对人CYP3A4和小型猪CYP3A基因克隆、HepG_2稳定表达细胞株的建立、以及在微粒体和全细胞两个水平对稳定表达细胞株的CYP3A特异性底物和抑制剂的鉴定,旨在分子水平阐明Bama小型猪的药物代谢特征,从而为Bama小型猪作为临床前药物代谢模型实验动物提供实验依据。 二、研究内容和结果 1.人CYP3A4基因和Bama小型猪CYP3A基因的克隆 用总RNA经逆转录PCR获得目的基因,并将目的基因亚克隆至pMD-19-T上,测序确认获得了人CYP3A4,以及小型猪的CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39和CYP3A88共5个基因;其中人CYP3A4、小型猪CYP3A39和CYP3A88与GeneBank中公布的序列完全一致;CYP3A29基因与NCBI记录的CYP3A29基因序列(GENE ID:403324)有2个碱基不同,即G96A、T105A,但其编码相同的CYP3A29的氨基酸酸序列(NP 999588);但获得的CYP3A22基因与GeneBank中公开的基因序列(AB006010.1)有6个碱基不同,即G 36 C、A 169 G、C 546 T、A 612 C、C1329 T和A 1351G,将该序列推定的蛋白质氨基酸序列与CYP3A22(BAD06180.1)进行比对发现有3个氨基酸差异,即W 12 C、W 57 V、N 451 D,且对来自5头小型猪的基因经过PCR扩增后测序结果完全一致,故此序列可能为Bama小型猪特有。 2.稳定表达人CYP3A4基因和Bama小型猪CYP3A基因HepG_2细胞株的建立及探针药物代谢鉴定 将克隆载体pMD-19-T上人CYP3A4和小型猪CYP3A系列的基因,在其5′和端3′插入酶切位点,并在3′插入6个组氨酸核苷酸序列,克隆至表达载体pcDNA3.1上,分别测序确认;将表达载体经脂质体转染至HepG_2细胞,经10代抗性筛选及RT-PCR、West-blot检测表明本研究成功建立了所需CYP3A基因在HepG_2中的稳定表达体系;以人CYP3A的特异性底物硝苯地平和睾酮为探针鉴定重组细胞的药物代谢活性,结果表明所得人CYP3A4和小型猪CYP3A基因HepG_2稳定表达株具有硝苯地平氧化代谢和睾酮6β-羟基化活性。 3.稳定表达人CYP3A4基因和Bama小型猪CYP3A基因HepG_2细胞微粒体对探针药物的代谢表征分析 以硝苯地平和睾酮作为探针底物,酮康唑作为抑制剂进行体外药物代谢的动力学分析,结果如下。 (1)人CYP3A4与Bama小型猪CYP3A重组细胞中微粒体对硝苯地平的体外代谢符合米氏动力学特征,其中CYP3A4、CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39和CYP3A88的Vmax分别为1.62、1.27、1.72、1.22和1.63nmol/min/mg,Km分别为12.12、18.98、12.83、18.42和12.46μM,内在清除率(Clint=Vm/Km)分别为133.66、66.91、134.06、66.23和130.29μL/min/mg。这些数据表明,CYP3A29和CYP3A88与CYP3A4的代谢特征极为相似,而CYP3A22和CYP3A39与CYP3A4的硝苯地平代谢差异较大。 (2)重组细胞微粒体代谢睾酮符合Hill动力学特征,CYP3A4、CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39和CYP3A88的Hill系数分别为1.14、1.61、1.34、1.62和1.35,说明本实验获得的重组CYP3A酶对睾酮的代谢均属于正协同作用;Vmax分别为7.13、4.34、6.21、4.15和6.08nmol/min/mg,S_(50)分别为41.87、73.64、50.08、69.76和50.24μM mol/L,Clint(Vm/S50)分别为172.06、58.90、124.0、59.49和121.03μL/min/mg,表明在对睾酮的6β-羟基化代谢中CYP3A4、CYP3A29和CYP3A88的酶作用效能比较接近。 (3)本实验获得酮康唑对硝苯地平代谢反应抑制的IC_(50)值,CYP3A4、CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39分别为0.132、0.233、0.090、0.262、0.104μM;对睾酮的代谢的IC_(50)值分别为0.032、0.0688、0.0562、0.077和0.065μM,这些数据表明酮康唑不论对硝苯地平或睾酮的代谢,其对CYP3A4、CYP3A29和CYP3A88抑制活性均较近。 4.稳定表达人CYP3A4基因和Bama小型猪CYP3A基因稳定表达HepG_2全细胞对探针药物的代谢表征分析 用基因重组全细胞体外孵育的方法,比较小型猪HepG_2-CYP3A与人HepG_2-CYP3A4的硝苯地平、睾酮和酮康唑代谢表征,其结果如下。 (1)重组全细胞的硝苯地平体外孵育代谢符合米氏动力学特征,HepG_2-CYP3A4、HepG_2-CYP3A22、HepG_2-CYP3A29、HepG_2-CYP3A39和HepG_2-CYP3A88的酶动力学参数,Vmax分别为2.21、1.52、2.51、1.40和2.46nmol/min/mg,Km分别为16.77、20.51、15.47、21.93和15.56μM,其内源性清除率Clint分别为131.78、74.11、162.25、63.84和157.97μL/min/mg,这些数据表明重组全细胞的硝苯地平代谢特征与微粒体实验类似,CYP3A29和CYP3A88对硝苯地平的代谢动力学特征与CYP3A4的代谢特征近似。 (2)重组全细胞的睾酮体外孵育代谢符合Hill动力学特征,HepG_2-CYP3A4、HepG_2-CYP3A22、HepG_2-CYP3A29、HepG_2-CYP3A39和HepG_2-CYP3A88的酶动力学参数,Vmax分别为2.55、1.83、2.37、1.72和2.39nmol/min/mg,Km分别为14.14、23.66、16.88、21.48和17.81μM,内源性清除率(Clint)180.40、77.59、140.36、93.20和134.40μL/min/mg,这些数据表明HepG_2-CYP3A4与HepG_2-CYP3A29和HepG_2-CYP3A88代谢特征较为相似,而与HepG_2-CYP3A22和HepG_2-CYP3A39的差别较大。 (3)重组全细胞酮康唑对硝苯地平代谢的IC_(50)值,HepG_2-CYP3A4、HepG_2-CYP3A22、HepG_2-CYP3A29、HepG_2-CYP3A39和HepG_2-CYP3A88,分别为0.539、0.8785、0.4985、0.8787和0.556μM;对睾酮的IC_(50)值分别为0.120、0.207、0.125、0.229和0.128μM,这些数据表明酮康唑对HepG_2-CYP3A4、HepG_2-CYP3A29和HepG_2-CYP3A88的睾酮代谢的抑制均较近,且显著高于对CYP3A22和CYP3A39的抑制活性。 5.结论 通过对人CYP3A4基因和Bama小型猪CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39和CYP3A88基因重组细胞的微粒体和全细胞的CYP3A特异性探针底物的硝苯地平和睾酮代谢活性,以及CYP3A的特异性抑制剂的体外孵育实验表明,人CYP3A4与Bama小型猪CYP3A29和CYP3A88具有较近的底物代谢表征,证实了前人提出的CYP3A29是CYP3A4在小型猪体内的同源酶的假说;同时发现CYP3A88也具有同CYP3A4较近的药物代谢表征,提示有必要进行进一步的研究,探索其内在的生物学基础。CYP3A22和CYP3A39之间具有近似的体外探针药物代谢表征,二者与CYP3A4、CYP3A29和CYP3A88之间具有较大的体外探针药物代谢表征差异。


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