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《重庆医科大学》 2009年
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CGRP在高氧诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤中的作用及其信号转导途径探讨

付红敏  
【摘要】: 第一部分早产胎鼠肺泡II型上皮细胞分离、纯化、培养及鉴定 目的 探讨胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的分离、纯化及原代培养方法,建立胎鼠AECⅡ细胞模型,为有关胎儿肺发育及新生儿肺部疾病的研究奠定基础。 方法 采用胰酶结合胶原酶的消化方法,分离肺组织细胞成份,然后经差速离心和差速贴壁的方法纯化AECⅡ,进行原代培养;通过台盼蓝染色检测细胞活力,倒置相差显微镜观察细胞生长特点及形态特征,透射电镜鉴定,改良巴氏染色检测细胞纯度以及免疫荧光技术检测表面蛋白C(SP-C)的表达。 结果 每3~5只胎鼠可获得AECⅡ(36±5)×106,活力(98±2)%。镜下观察原代AECⅡ呈岛状生长,外观呈多边形或立方形。透射电镜可见特征性的板层小体,改良巴氏染色见胞质内有较多颗粒,纯度为96±3%,呈现SP-C绿色免疫荧光的细胞占96%以上。 结论 利用胰酶和胶原酶消化,以及差速离心和差速贴壁的方法可成功分离出高产量、高纯度的胎鼠AECⅡ,能满足体外进一步实验的需要。 第二部分高氧暴露对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的氧化损伤及CGRP的保护作用 目的 观察高氧对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的影响以及降钙素基因相关肽(CGRP)对AECⅡ的保护作用。 方法 将原代分离培养的孕19d早产鼠AECⅡ接种至6孔培养板,实验随机分为空气组、高氧组、高氧CGRP组、高氧CGRP受体拮抗剂组。空气组和高氧组分别置于体积分数为21%的空气和60%的氧气中暴露24h;高氧CGRP组在暴露前加入CGRP;高氧CGRP拮抗剂组在高氧CGRP组基础上加入CGRP受体拮抗剂(CGRP8-37)。培养24h后,用分光光度计测定各组丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(TAOC)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;用流式细胞仪检测活性氧(ROS)和细胞凋亡率;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定表面活性蛋白C (SP-C)的mRNA表达。 结果 与空气组比较,高氧组MDA、ROS及细胞调亡率均显著增高,TAOC、SOD水平及SP-C mRNA表达均显著降低(P均0.01)。与高氧组比较,高氧CGRP组细胞MDA、ROS水平及细胞调亡率均显著下降;而TAOC、SOD水平及SP-C mRNA表达均明显增高(P0.01)。高氧CGRP拮抗剂组与高氧组各指标比较差异均无统计学意义。 结论 60%氧暴露24h可导致早产鼠AECⅡ发生氧化损伤,诱导细胞凋亡及SP-C mRNA表达下降;而CGRP可部分减轻AECⅡ的氧化损伤,减少凋亡,促进SP-CmRNA表达,对高氧损伤的AECⅡ起保护作用。 第三部分CGRP对60%氧暴露早产鼠AECⅡ生长增殖的影响 目的 探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对60%氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)生长增殖的影响。 方法 原代分离培养孕19d早产鼠AECⅡ,随机分为6组:空气组、空气CGRP组、空气CGRP拮抗剂组、高氧组、高氧CGRP组、高氧CGRP拮抗剂组。空气组和高氧组分别在氧体积分数为21%的空气和60%的氧气中暴露24h;空气或高氧CGRP组在置于空气或高氧环境前加入CGRP;空气或高氧CGRP拮抗剂组同时加入CGRP和CGRP受体拮抗剂后,再置于空气或60%的氧气中培养24h。先用MTT比色法测定不同浓度CGRP(10-10~10-7M)对正常AECⅡ生长的影响,以确定CGRP的实验最佳浓度;分别采用MTT法和流式细胞术测定各组细胞增殖能力和细胞周期,逆转录聚合酶链反应和免疫荧光技术测定表面活性蛋白C (SP-C)的mRNA及蛋白表达。 结果 MTT法结果显示,CGRP从10-10~10-8M,呈剂量依赖方式促进正常培养的早产鼠AECⅡ生长,因此选择10-8M CGRP来干预细胞。加入10-8M CGRP还可使正常培养的AECⅡ进入G2/M及S期的比例增多,SP-C mRNA及SP-C蛋白表达增高(与空气组相比,P均 0.01)。暴露于60%氧24h后,细胞存活率下降,G0/G1期细胞比例增高,G2/M及S期细胞相应降低,SP-C mRNA及SP-C蛋白表达低下(与空气组比较,P均0.01)。而预先加入10-8M CGRP后,促进了高氧暴露AECⅡ的增殖能力,使S及G2/M期细胞增多,并可提高AECⅡ的SP-C mRNA及SP-C蛋白表达水平(与高氧组及高氧CGRP拮抗剂组比较,P0.01)。 结论 60%氧暴露24h可抑制早产鼠AECⅡ增殖分化,而CGRP可促进AECⅡ生长,部分解除高氧对AECⅡ的抑制作用。 第四部分PKCα信号转导途径介导了CGRP对高氧肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的保护作用 目的 通过测定PKCα和NF-κB的活化情况,从细胞内信号转导通路这一角度探讨CGRP对高氧肺泡上皮细胞损伤的保护作用机制。 方法 原代分离培养孕19d早产鼠AECⅡ,随机分为6组:空气组、空气CGRP组、空气CGRP拮抗剂组、高氧组、高氧CGRP组、高氧CGRP拮抗剂组。空气组和高氧组分别在氧体积分数为21%的空气和60%的氧气中暴露24h;空气或高氧CGRP组在置于空气或高氧环境前加入CGRP,空气或高氧CGRP拮抗剂组同时加入CGRP和CGRP受体拮抗剂,再置于空气或60%的氧气中培养24h。用Western blot检测胞膜和胞浆PKCα的表达变化,激光共聚焦检测NF-κB的核表达情况。 结果 在正常培养的AECⅡ细胞中加入CGRP后,胞膜与胞浆PKCα的比值显著增高,NFκB的荧光较强,与空气组及空气CGRP拮抗剂组相比有显著性差异(P0.01)。细胞暴露于高氧后,胞膜与胞浆PKC比值显著低于空气组,而NFκB的荧光强度高于空气组(p0.01)。高氧CGRP组二者比值及核内NFκB荧光强度高于高氧组及高氧CGRP拮抗剂组,差异有显著性意义(p0.01)。 结论 PKCα介导了CGRP对细胞的信号传递过程,参与了CGRP对高氧AECⅡ损伤的保护作用,而NF-κB是PKCα的下游信号,部分执行了PKCα传递的保护功能
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R363

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【参考文献】
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