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《重庆医科大学》 2009年
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表皮生长因子受体介导的乳腺癌靶向性基因治疗导入系统研究

袁飞  
【摘要】: 恶性肿瘤严重威胁着人类的健康。目前,手术、放射治疗、化疗及中医药等综合治疗取得了很大进展,但效果仍不理想。随着现代分子生物学及其相关学科的飞速发展,肿瘤基因治疗将成为除手术,放疗和化疗等传统方法外又一新的抗癌策略;尤其将在传统治疗手段效果较差的肿瘤转移和复发方面将起重要作用。基因治疗至今尚未成为临床常规治疗措施,其关键原因之一就是缺乏高效靶向基因导入载体。表皮生长因子受体(EGFR)由于在乳腺癌中有高表达,而在正常乳腺组织中表达水平较低,因此是一个很好的靶点。本研究旨在建立一种靶向EGFR受体的基因导入系统并检验其有效性,为乳腺癌的靶向性基因治疗提供可靠的理论依据与实践指导。 通过表皮生长因子受体(EGFR)介导增加癌细胞对表皮生长因子(EGF)偶联纳米载体所载的药物、抗体、基因等的摄取,提高所载药物、抗体、基因等的靶向性。本课题研究制备高稳定性和高靶向性的纳米载体,并荷载靶向基因,在肿瘤的诊断治疗中,以达到更好的靶向性。 表皮生长因子受体(EGFR)参与激活一系列复杂的细胞信号转导途径,广泛表达于上皮、间质及神经组织。在许多恶性肿瘤可出现一种或几种EGFR家族受体过表达和(或)突变,过表达和(或)突变在各种肿瘤组织中表达率不同,且与肿瘤的分化程度、恶性程度及浸润程度、放化疗敏感性、肿瘤耐药性及预后等密切相关。EGFR家族被认为是抗肿瘤治疗的重要分子靶点。 白蛋白具有无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等优点,其制备的纳米粒具有提高药物、抗体、基因等的稳定性和进入细胞的能力。根据纳米载体本身的特性结合机体在肿瘤发生时所产生的病理生理变化,可以制作出具有EGFR靶向特征的纳米载体,达到在特定机体环境中的靶向作用。 表皮生长因子受体(EGFR)与c-erbB2癌基因具有组织分布一致性的特点,在乳腺癌细胞中普遍存在着二者的同时过度表达,而在正常乳腺组织中含量都很低,所以表皮生长因子(EGF)连接白蛋白纳米粒制成靶向纳米粒有以下优势:①通过EGF与其受体EGFR结合,增加了载药纳米粒在癌细胞膜上的浓聚,加大了细胞内外药物的浓度差,有利于癌细胞摄取,增加了靶/非靶比值;②通过这种受体与配体的特异性结合促进癌细胞吞噬纳米粒,增加进入癌细胞的速度和量,从而增加所荷载的药物、抗体、基因结合靶分子的速度和量。本课题采用EGF偶联牛血清白蛋白纳米载体(bovine serum albumin,BSA)增加所荷载基因(c-erbB2寡脱氧核苷酸)的稳定性和靶向性。 方法: 1.BSA纳米载体与EGF偶联BSA纳米载体的制备及放射性核素的标记及鉴定 采用二次超声乳化技术和溶剂挥发技术制备牛血清白蛋白纳米载体(bovine serum albumin nano-carrier,BSA nano-carrier),采用激光粒径仪测定纳米粒的粒径和分布,用透射电镜观察纳米粒的形态。采取Iodogen将~(131)I标记上BSA nano-carrier,再用Sephadex G25柱层析进行纯化,硅胶薄层层析测定标记率、比活度及放射化学纯度。分别测定~(131)I-BSAnano-carrier室温和与新鲜人血清37℃孵育后放射化学纯度的变化,了解其在室温和血清中的稳定性。 采用化学方法连接BSA nano-carrier与EGF,测定连接后的粒径及粒径分布,Sephadex G50分离纯化EGF-BSA nano-carrier。聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定EGF-BSA nano-carrier的连接情况,用~(131)I标记EGF测定EGF-BSA nano-carrier上EGF的偶联量。 2.~(131)I-EGF-BSA靶向纳米载体导入荷乳腺癌裸鼠的体内分布 分别比较~(131)I标记EGF偶联BSA纳米载体,BSA纳米载体和BSA(非纳米载体)在乳腺癌SK-BR3细胞导入裸鼠的体内分布。通过统计分析比较各器官的瘤/血比值和瘤/肌肉比值。 3.表皮生长因子受体靶向纳米载体荷载c-erbB2反义寡脱氧核苷酸对人乳腺癌SK-BR3细胞的摄取与滞留 采取氯胺T法将~(131)I标记c-erbB2反义寡脱氧核苷酸(Antisenseoligodeoxynucleotide,ASODN),采用包裹法对~(131)I标记ASODN进行EGF偶联纳米载体包载。分别测量荷~(131)I标记ASODN nano-carrier和~(131)I-ASODN在人乳腺癌SK-BR3细胞的摄取率和滞留率及在荷人乳腺癌裸鼠的体内分布,并统计分析荷~(131)I标记ASODN靶向纳米载体与~(131)I标记ASODN在体内各器官的分布及瘤/血比值和瘤/肌肉比值。 结果: 1.BSA纳米载体与EGF偶联BSA纳米载体的制备及放射性核素的标记及鉴定 1.1 BSA纳米载体的制备及鉴定 用透射电镜进行观察,纳米载体的形态圆整,大小粒径较均匀。采用激光散射法测定的BSANP平均粒径为34nm,90%的粒径小于38nm。 ~(131)I-BSANP的~(131)标记率为92.3%±3.9%,比活度为(3.1±0.7)MBq/μg。Sephadex G25分离纯化得到的第1放射峰即为~(131)I-BSANP,经24h稳定性分析,其放射化学纯度略有降低,但24h均值大于80%。与新鲜人血清37℃孵育分析其稳定性,经纸层析分析测得放射化学纯度4h比1h略有降低,但4h均值大于85%。 -20℃保存1d后BSANP的~(131)I标记率为(89.7±6.4)%,15d为(86.2±5.7)%,30d为(84.3±5.2)%,90d后为(81.2±5.5)%。 1.2 EGF偶联BSA纳米载体的制备及鉴定 SDS-PAGE电泳显示,BSA nano-carrier样品电泳条带与Marker 68kU接近,而EGF-BSA nano-carrier样品电泳条带与Marker 75kU接近。 加入5组不同量的EGF与BSA nano-carrier的偶联率为92.3%~98.9%。室温稳定性测定,在1h、6h、12h和24h同一时间点,组内无显著性(P>0.05),同组在24h内放化纯度差异有显著意义(P<0.05),做回归分析,F值为30.46时间与放射纯度呈线性相关,回归方程为Y=99.37-3.451X,R~2为0.942,n=3。结果显示,~(131)I-EGF-BSAnano-carrier在中性pH溶液中,室温24h内具有较好的稳定性,~(131)I不易脱落。血清稳定性,在1h、6h、12h和24h同一时间点,组内无显著性(P>0.05),在24h内放化纯度差异有显著意义(P<0.05),做回归分析F值为87.98时间与放射纯度呈线性相关,回归方程为Y=99.86-4.156X,R~2为0.981,n=3。结果显示,~(131)I-EGF-BSA nano-carrier在血清中,24h内具有较好的稳定性,~(131)I不易脱落。 2.~(131)I标记EGF偶联BSA靶向纳米载体在荷乳腺癌裸鼠的体内分布 ~(131)I标记EGF偶联BSA靶向纳米载体的放射性瘤/血比值和瘤/肌肉比值逐渐升高,在2h达峰值,后略有下降。~(131)I-BSA nano-carrier放射性的瘤/血比值和瘤/肌肉比值升降趋势与~(131)I标记EGF偶联BSAnano-carrier相似,但同一时间点的放射性瘤/血比值和瘤/肌肉比值均相对较低。将~(131)I标记EGF偶联BSA nano-carrier,~(131)I标记BSA纳米载体和~(131)I-BSA(非纳米)的瘤/血比值做方差分析:各药物组间均方MS=3.203,F=14.86,R~2=0.725,p<0.01,三种药物的瘤/血比值有统计学差异。三种药物瘤/肌肉比值做方差分析:各药物组间均方MS=15.814,F=6.443,R~2=0.403,p=0.005,p<0.01,三种药物的瘤/肌肉比值有统计学差异。 ~(131)I标记EGF偶联BSA nano-carrier和~(131)I-BSA(非纳米)的瘤/血比值做t检验:Levene's方差齐性检验:F=1.336,p=0.26,方差齐,t=3.467,p=0.02,p<0.05,差异有显著性。~(131)I标记EGF偶联BSA nano-carrier和~(131)I-BSA纳米载体的瘤/血比值做t检验:Levene's方差齐性检验:F=3.373,p=0.08,方差齐,t=2.405,p=0.025,p<0.05,差异有显著性。所以~(131)I标记EGF偶联BSA nano-carrier的瘤/血比值高于其它两种药物,差异具有显著性。 将~(131)I标记EGF偶联BSA nano-carrier,~(131)I-BSA nano-carrier和~(131)I-BSA(非纳米)在肿瘤的分布做方差分析:各药物组间均方MS=171.994,F=107.499,R~2=0.889,p<0.01,三种药物的在肿瘤的分布有统计学差异。 将~(131)I标记EGF偶联BSA nano-carrier,~(131)I-BSA nano-carrier和~(131)I-BSA(非纳米)在肝的分布做方差分析:各药物组间均方MS=11.594,F=4.561,R~2=0.608,p=0.019,p<0.05,三种药物的在肝的分布有统计学差异。 将~(131)I标记EGF偶联BSA nano-carrier,~(131)I-BSA nano-carrier和~(131)I-BSA(非纳米)在肺的分布做方差分析:各药物组间均方MS=14.059,F=8.102,R~2=0.623,p=0.02,p<0.05,三种药物的在肺的分布有统计学差异。 将~(131)I标记EGF偶联BSA nano-carrier,~(131)I-BSA nano-carrier和~(131)I-BSA(非纳米)在脾的分布做方差分析:各药物组间均方MS=9.870,F=6.164,R~2=0.758,p=0.006,p<0.01,三种药物的在脾的分布有统计学差异。 将~(131)I标记EGF偶联BSA nano-carrier,~(131)I-BSA nano-carrier和~(131)I-BSA(非纳米)在肾的分布做方差分析:各药物组间均方MS=32.187,F=17.672,R~2=0.757,p<0.01,三种药物的在肾的分布有统计学差异。 ~(131)I-EGF-BSA nano-carrier对裸鼠体内的人乳腺癌SK-BR3肿瘤具有较好的靶向性,而在肝,脾,肺等正常组织器官的分布较少,表明新的纳米载体靶向性较好,而且毒副作用较低。 3.表皮生长因子受体靶向纳米载体荷载c-erbB2反义寡脱氧核苷酸对人乳腺癌SK-BR3细胞的摄取与滞留 c-erbB2反义寡脱氧核苷酸(c-erbB2 antisense oligodeoxynucleotide,c-erbB2 ASODN以下简称ASODN)联合EGF偶联BSA nano-carrier与ASODN组的放射性瘤/血比值和瘤/肌肉比值升降趋势相似,但同一时间点,ASODN组的放射性瘤/血比值和瘤/肌肉比值均相对较低。将ASODN联合EGF-BSA nano-carrier靶向纳米载体与ASODN组放射性的瘤/血比值做t检验:Levene's方差齐性检验:F=67.207,方差齐,t=5.092,p<0.05,差异有显著性。将ASODN联合EGF偶联BSA nano-carrier靶向纳米载体与ASODN组的放射性瘤/肌肉比值做t检验:Levene's方差齐性检验:F=32.92,方差齐,t=9.477,p<0.01,差异有显著性。ASODN联合EGF-BSA nano-carrier靶向纳米载体组较ASODN组的瘤/血比值和瘤/肌肉比值高,有统计学差异。 将ASODN联合EGF-BSA nano-carrier靶向纳米载体与ASODN在肿瘤的分布做t检验:Levene's方差齐性检验:F=34.958,方差齐,t=5.242,p<0.01,在肿瘤的分布有统计学差异。 将ASODN联合EGF-BSA nano-carrier靶向纳米载体与ASODN在肝的分布做t检验:Levene's方差齐性检验:F=20.896,方差齐,t=16.347,p<0.01,在肝的分布有统计学差异。 将ASODN联合EGF-BSA nano-carrier靶向纳米载体与ASODN在脾的分布做t检验:Levene's方差齐性检验:F=19.344,方差齐,t=18.992,p<0.01,在脾的分布有统计学差异。 将ASODN联合EGF-BSA nano-carrier靶向纳米载体与ASODN在肾的分布做t检验:Levene's方差齐性检验:F=8.999,p=0.007,方差齐,t=1.909,p=0.069,p>0.05,在肾的分布统计学无差异。 采用EGF-BSA nano-carrier靶向纳米载体能够提高ASODN在荷乳腺癌裸鼠体内的靶与非靶比值,并增加ASODN其在体内的稳定性和靶向性。 结论:由于牛血清白蛋白本身具有良好的理化性质,所制成的EGF靶向纳米载体具有理想的粒径和良好的稳定性,使其具有纳米载体的一般性质的同时在靶向性方面又明显优于普通纳米载体。通过研究c-erbB2联合EGF偶联BSA靶向纳米载体对乳腺癌SK-BR3细胞的靶向性,证明所制作的EGF偶联BSA纳米载体是一个稳定且靶向性较强的新载体。
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