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《重庆医科大学》 2009年
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As_2O_3对H_(22)细胞源exosome外泌的影响及其与exosome联合应用的治疗性研究

向自武  
【摘要】: Exosome是由细胞多泡体外泌到细胞外的膜性小囊泡。他们参与了多种生理、病理过程,有望成为生物医学研究和应用开发的技术平台。但exosome的体积小,密度低,提取过程繁杂、产量也低,从而制约了对exosome的进一步研究。资料表明,exosome的外泌与胞内Ca~(2+)浓度变化有一定关系。诱导Ca~(2+)内流的Na~+/H~+交换剂(monensin)可促进K562细胞源性exosome的外泌。而Ca~(2+)拮抗剂BAPTA-AM可抑制此过程。 三氧化二砷,是砒霜的主要成分,对急性早幼粒细胞性白血病(APL)有较好疗效,也具有促进肝癌等多种肿瘤细胞凋亡的作用。同时有研究表明,三氧化二砷具有提高胞内Ca~(2+)浓度的作用。结合这些特点本研究选用三氧化二砷作为干预因素,探讨小鼠肝癌细胞(H_(22))源exosome外泌的变化。 资料显示:膜融合机制——SNARE(soluble NSF attachment proteinreceptor)是解释神经内分泌细胞胞吐过程的机制之一。此过程受胞内Ca~(2+)影响。exosome的生成与循环过程,与神经递质出入神经元的胞吐与胞吞过程类似,且exosome与神经内分泌囊泡在形态和大小上也非常接近。本研究拟检测小鼠肝癌细胞(H_(22))在外泌exosome过程中有无SNARE相关蛋白的表达及表达变化。为进一步探讨和阐明exosome外泌机制奠定基础。另外,也观察exosome与三氧化二砷联合应用对小鼠皮下种植性肝癌模型的治疗效应。 方法: 1三氧化二砷对小鼠肝癌细胞(H_(22))源exosome外泌的影响:用MTT法测定H_(22)细胞生长曲线,确定三氧化二砷对H_(22)细胞抑制率为10%的药物浓度,并确立H_(22)细胞源exosome提取的最佳收集细胞培养液时间;采用超速分级离心和蔗糖密度梯度离心法提取纯化exosome;利用Bradford法定量exosome总蛋白;借助荧光探针Fura-2和倒置荧光显微镜测Ca~(2+)系统检测细胞胞内Ca~(2+)的变化;采用免疫印迹法(Western blot)检测SNARE复合物相关蛋白——syntaxin。 2三氧化二砷与小鼠肝癌细胞(H_(22))源exosome联合应用对小鼠皮下种植性H_(22)肝癌模型的治疗性研究:小鼠皮下接种H_(22)细胞(5×10~5个/只)后的第2天开始腹腔注射三氧化二砷,1次/天,连续10d。第4天开始皮下注射H_(22)源exosome,每隔4天一次,连续3次。观察各组肿瘤生长情况。于肿瘤细胞接种后第25天记录存活率,处死存活小鼠称取体重并解剖肿瘤称瘤重,计算肿瘤抑制率。免疫组织化学法检测各组肿瘤组织中CD4~+、CD8~+T淋巴细胞浸润情况。 结果: 1三氧化二砷对小鼠肝癌细胞(H_(22))源exosome外泌的影响: 1.1密度为5×10~4个/ml的H_(22)细胞在培养的第24~48h生长最活跃,即为对数生长期。三氧化二砷对H_(22)细胞48h抑制率为10%的药物浓度是1.25μmol/L。从200ml H_(22)细胞上清液中可提取exosome 2ml。三氧化二砷实验组与对照组exosome总蛋白浓度分别为(0.96±0.10)mg/ml、(0.85±0.13)mg/ml(P<0.05)。 1.2倒置荧光显微镜测Ca~(2+)系统显示,对照组H_(22)细胞胞内Ca~(2+)相对浓度为0.58±0.04。用1.25μmol/L三氧化二砷的培养液培养6、12、24、48h后H_(22)细胞内Ca~(2+)相对浓度分别为0.62±0.04、0.71±0.03、0.78±0.03、0.68±0.03(P<0.05)。 1.3 Western blot结果表明,用1.25μmol/L三氧化二砷的培养液培养12、24、48h后,H_(22)细胞表达syntaxin蛋白量增多。 2三氧化二砷与小鼠肝癌细胞(H_(22))源exosome联合应用对小鼠皮下种植性肝癌模型的治疗性研究: 2.1小鼠皮下种植性肝癌(H_(22))的生长情况: 从小鼠皮下接种H_(22)细胞后第16天开始呈现出差异:两联合组、三氧化二砷组肿瘤的平均体积小于同一天对照组肿瘤的平均体积(P<0.05),也小于EXOn组、EXOa组肿瘤的平均体积(P<0.05);两联合组之间,联合组与三氧化二砷组之间无差异(P>0.05)。从第20天起,联合组肿瘤的平均体积小于同一天三氧化二砷组肿瘤的平均体积(P<0.05),也小于对照组肿瘤的平均体积(P<0.05)。两EXO组间及两联合组间肿瘤体积自始至终无差异(P>0.05)。两EXO组与对照组自始至终无差异(P>0.05)。 2.2各组小鼠的存活率: 小鼠皮下接种H_(22)肝癌细胞的第25天,对照组、三氧化二砷组、(三氧化二砷+EXOn)联合组、(三氧化二砷+EXOa)联合组、EXOn组、EXOa组小鼠的存活率分别为30%、50%、70%、80%、30%、30%。各组小鼠的生存率有差异,但是统计分析尚不能得出差异有统计学意义。 2.3小鼠肝癌(H_(22))的肿瘤抑制率: 三氧化二砷组、(三氧化二砷+EXOn)联合组、(三氧化二砷+EXOa)联合组、EXOn组、EXOa组的肿瘤抑制率分别为44.58%、66.27%、65.06%、4.82%、6.03%。 2.4肝癌(H_(22))组织中CD4~+、CD8~+T淋巴细胞的浸润: 对照组、三氧化二砷组、(三氧化二砷+EXOn)联合组、(三氧化二砷+EXOa)联合组、EXOn组、EXOa组肝癌组织中CD4~+T淋巴细胞的平均光密度值分别为0.12±0.02、0.18±0.03、0.32±0.08、0.34±0.06、0.13±0.05、0.14±0.04。CD8~+T淋巴细胞的平均光密度值分别为0.11±0.01、0.15±0.02、0.18±0.04、0.20±0.03、0.13±0.02、0.12±0.03。与对照组比较,两EXO组(EXOn、EXOa)无统计学差异(P>0.05);联合组、三氧化二砷组有统计学差异(P<0.05)。与三氧化二砷组比较,联合组有统计学差异(P<0.05)。两联合组之间、两EXO组之间无统计学差异(P>0.05)。 结论: 1、低浓度三氧化二砷(1.25μmol/L)能够提高细胞内Ca~(2+)浓度,促进syntaxin蛋白表达,促进小鼠肝癌细胞(H_(22))exosome的分泌。说明小鼠肝癌细胞源exosome的外泌过程与神经内分泌胞吐过程相似。 2、exosome与三氧化二砷对小鼠皮下H_(22)种植性肝癌模型有协同治疗效应,说明exosome在肿瘤的治疗方面也有一定作用。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R73-3

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