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抗HIF-1α肺腺癌人源单链抗体制备及在荷人肺腺癌裸鼠体内的放射免疫显像

王洁  
【摘要】: 肺癌是一种常见的恶性肿瘤,80%以上都属非小细胞肺癌,肺腺癌是非小细胞肺癌中非常重要的一种病理类型。目前肺癌的发病率呈逐年增长的势头,而且大部分肺癌患者确诊时已发展到了中晚期,因此对人类的健康有着很严重的威胁。由于肺癌早期不容易诊断,主要治疗手段如手术、化学药物治疗、外放疗对肺癌的有效率又不是很理想,而且还有诸多不良反应,所以肺癌的早期诊断和治疗急须研究出新的有效途径。目前,放免显像和放免治疗成为国内外诸多学者争相研究的热点。将放射性核素标记特异性的抗体,通过抗原-抗体免疫反应机制导向性地将放射性核素引入体内,一方面利用外部的放射性探测设备对疾病进行诊断,另一方面放射性核素可以释放射线来对病变组织进行破坏,起到治疗的作用。放免显像和放免治疗已成为生物治疗领域的一个很重要的方向,在肿瘤的早期诊断、正确分期、有效治疗方面发挥着越来越重要的作用。 选择好的靶点,制备出特异性的抗体是放免显像及治疗的关键。缺氧诱导因子1是肿瘤缺氧时发挥重要作用的转录调节因子,HIF-1α是其主要功能亚基。很多研究证实HIF-lα在非小细胞肺癌肿瘤中高表达,而且与肿瘤组织的生长、侵袭和转移都密切相关,有可能成为肺癌诊断和治疗的新的有效靶点。在抗体的选择上,噬菌体单链抗体摒弃了单克隆抗体的人抗鼠抗体反应,是完全的人源性抗体,同时相对分子量小、穿透力好、免疫原性弱、易清除,比单克隆抗体有更大的优势,有望在临床上得到更广泛的应用。 为了找到有效的肺癌诊断、治疗的新方法,我们尝试从大容量噬菌体抗体库中筛选出特异抗HIF-1α的肺腺癌人源单链抗体,经放射性核素标记后进行荷人肺腺癌裸鼠体内的放射免疫显像。 目的:采用噬菌体抗体库技术制备抗HIF-1α肺腺癌人源单链抗体,行荷人肺腺癌裸鼠体内的放射免疫显像研究,为肺癌的免疫显像和治疗提供一条新的有效方法。 方法与结果: 第一部分抗HIF-1α肺腺癌人源单链抗体的制备 1.肺腺癌A549细胞、HIF-1α对噬菌体抗体库的筛选:正常支气管上皮细胞HBE16吸附后,以肺腺癌A549细胞、HIF-1α为抗原对噬菌体抗体库分别进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选,噬菌体回收率逐渐提高,最后一轮产出为5.9×105 cfu/ml,噬菌体抗体得到了富集。 2. ELISA、免疫细胞化学鉴定噬菌体抗体:挑取单菌落制备噬菌体抗体,ELISA检测10个中有5个与HIF-1α抗原反应呈阳性,阳性率为50%。免疫细胞化学鉴定显示筛选出的噬菌体抗体使肺腺癌A549细胞明显深染,证实此抗体与肺腺癌A549细胞特异结合,却不与乳腺癌MDA-MB-435s细胞结合。 3.可溶性抗HIF-1α单链抗体的表达、纯化:将ELISA鉴定强阳性的重组噬菌体感染E.coli HB2151,经IPTG诱导进行可溶scFv的表达。用SDS-PAGE鉴定出scFv成功可溶表达的菌液,并过HiTrapTM Anti-E Tag柱纯化。纯化可溶scFv经Western-blot鉴定,进一步证明scFv的可溶表达和纯化的成功,且测定可溶scFv相对分子量在30kDa左右。 4. ELISA鉴定可溶scFv的免疫活性:ELISA显示肺腺癌细胞A549的D(450)为0.61±0.08,乳腺癌细胞MDA-MB-435s的D(450)为0.30±0.06,正常支气管上皮细胞HBE16的D(450)为0.29±0.07,证明可溶scFv具备较高的免疫活性,与肺癌细胞A549结合,而不与乳腺癌细胞MDA-MB-435s、正常支气管上皮细胞HBE16结合。竞争抑制ELISA显示可溶scFv与游离的HIF-1α产生抑制效应,效应与游离HIF-1α的剂量相关,证明可溶scFv与HIF-1α有较高结合活性。 第二部分131I-可溶scFv在荷人肺腺癌裸鼠体内的放射免疫显像和图像融合 1.抗HIF-1α可溶scFv的放射性核素标记、纯化及鉴定:采用氯胺T法对制备的抗HIF-1α可溶scFv进行131I标记,标记液过Sephadex G200柱纯化。三氯醋酸沉淀法测131I-可溶scFv的标记率为79.6±4.9%,纸层析法分析放射化学纯度为94.4±4.4%,放射性比活度为3.2±0.2MBq/μg,室温放置24h和新鲜人血清中孵育48h各个时间点测定的放射化学纯度均在90%以上。 2.放射免疫显像和图像融合:建立荷人肺腺癌裸鼠模型,注射131I-可溶scFv,SPECT下行平面静态显像,ROI技术测定T/NT (肿瘤与非肿瘤区放射性计数比值),结果显示裸鼠肿瘤区域有选择性放射性浓聚,72h放射性浓聚到达高峰,T/NT最大达3.19。72h时SPECT/CT融合图像直观地显示肿瘤区域清晰显影。 结论:本研究利用单链大容量噬菌体抗体库技术成功制备了抗HIF-1α肺腺癌人源单链抗体,放射性核素~(131)I标记抗体后行放射免疫显像和图像融合,获得了较好的显像结果,为肺癌的早期免疫诊断、治疗奠定了一定的基础。


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